Ensayos Enzimáticos

Para estudiar la cinética es importante crear métodos confiables y reproducibles para la medición de la actividad enzimática en condiciones específicas. El propósito del ensayo enzimático es medir la rapidez de formación del producto o la rapidez de la desaparición del substrato(s) en condiciones controladas de temperatura, pH y concentración de compuestos modificadores de la actividad. Se usan dos tipos básicos de ensayos enzimáticos denominados: 1. Ensayos continuos: en los que el método ofrece una lectura continua de la actividad monitorizando a tiempo real el sustrato consumido o el producto generado. 2. Ensayos discontinuos: en los que la reacción se detiene en un punto y se mide la concentración de …ver más…

Esta es la forma más sencilla y común de analizar enzimas, y consiste en obtener curvas completas mediante control directo y continuo de la reacción. Los análisis espectrofotométricos son particularmente comunes en enzimas que utilizan coenzimas de nicotinamida que absorben a 340 nm en su forma reducida.

* Método colorimétrico: se utiliza cuando la luz absorbida se encuentra en el espectro visible, se observa un cambio de color en la muestra.

* Uso de la luz ultravioleta (UV): se usa especialmente porque sirve para monitorizar reacciones en las que participan NADH y NADHP, coenzimas que participan en infinidad de reacciones bioquímicas y que absorben luz UV en forma reducida (NADH y NADPH) pero no en forma oxidada (NAD+ y NADP+). Así la actividad de una oxidoreductasa que se use NADH como coenzima puede ser monitorizada siguiendo el descenso de la absorbancia a 340 nm a medida que se consume el NADH.

Fluorimétricos: en este ensayo se utiliza la fluorescencia, en la cual una molécula emite luz de una longitud de onda determinada tras absorber luz a otra longitud de onda. Los ensayos fluorimétricos usan la diferencia en la fluorescencia entre producto y sustrato para medir la reacción enzimática. Estos ensayos son generalmente mucho más sensibles que los espectrofotométricos, ya que son más específicos al tener que utilizar dos longitudes de onda en lugar de una, pero pueden sufrir más interferencias por impurezas presentes en el medio o por