TP 1: “Extracción de ADN cromosómico de Escherichia coli”
Objetivos
El objetivo del trabajo práctico es la extracción de ADN cromosómico a partir de un pellet de bacterias de Esterichia coli (E.coli)
Esquema del procedimiento
Para la extracción de ADN cromosómico se siguieron los siguientes pasos generales:
Degradación del tejido: partimos de un pellet de bacterias ya cosechadas por centrifugación, provenientes de 50 ml de cultivo de Escherichia coli (tipo salvaje), crecido en medio rico. Se tomó un inóculo de una colonia de una caja de Petri donde se sembraron las bacterias y se dejó crecer a 37° C en un medio líquido entre 12 y 16 horas. Dentro de este período no se llega a degradar el DNA.
Lisis celular: una vez que se tiene …ver más…

Según el mecanismo de Phillips, la lizosima se une a un hexasacárido deformando el cuarto azúcar (el anillo D) que adopta una conformación de media silla. En este estado de tensión el enlace glucosídico es fácilmente roto.
Se ha descubierto que el ácido glutámico 35 (Glu35) y el ácido aspártico 52 (Asp52) son indispensables para la actividad de esta enzima. El Glu35 actúa como donador de protones para el enlace glucosídico, cortando el enlace C-O en el sustrato. El Asp52 actúa como nucleófilo para generar el intermediario enzimático-glucosídico (complejo enzima-sustrato). Luego, este intermediario reacciona con una molécula de agua para volver a dejar intacta a la enzima y liberar el producto de la hidrólisis.
A partir de aquí continuamos trabajando a temperatura ambiente.
Agregamos 0,4 ml de Tritón X-100 9% v/v, mezclamos bien con la varilla y dejamos 30 minutos a temperatura ambiente. En este paso ocurre la lisis celular.
Tritón X-100: esta molécula anfipática actúa como un detergente. Esto quiere decir que tiene una parte no polar hidrofóbica y un extremo hidofílico, polar. Entendiendo la estructura de la membrana plasmática aplicamos determinada dosis de Tritón X-100 el cual se intercala en la membrana y formar micelas con los fosfolípidos. Así los lípidos se solubilizan, y las proteínas de membrana se exponen a