Laboratorio Nº 5: Enzimología II Determinación de las Propiedades Cinéticas de la Enzima Fosfatasa Acida de Germen de Trigo INTRODUCCIÓN Las enzimas son proteínas con un gran poder catalítico y un alto grado de especificidad por su sustrato. Estas proteínas poseen gran importancia en todos los procesos bioquímicos. Actuando en forma concertada, catalizan cientos de reacciones que llevan, entre otros, al metabolismo de nutrientes, la conservación o transformación de energía o la biosíntesis de macromoléculas. La reacción más simple que pueden catalizar las enzimas está representada por la ecuación:

Donde E, S y P, representan a la enzima, al sustrato y al producto, respectivamente, mientras que ES y EP representan los complejos …ver más…

Prepare 6 tubos que contengan: 1 2 3 4 5 6 pNP 60 uM (mL) 0,0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 NaOH 0,05 M (mL) 4,0 3,5 3,0 2,0 1,0 0,0 Para cada uno de los tubos lea la absorbancia a 405 nm. Verifique que su blanco sea el apropiado. Graficar la curva obtenida. 2.- Determinación de los parámetros cinéticos de la fosfatasa ácida de germen de trigo y el efecto del fosfato en la reacción. Prepare un serie de 10 tubos que contengan 1 2 3 4 5 pNPP 2,5 uM (mL) 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Buffer pH 5 (mL) 2,00 1,75 1,50 1,25 1,00 INCUBAR 5 min. A 37° Enzima 0,5 mg/mL (mL) 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 6 7 8 pNPP 2,5 uM (mL) 0,00 0,25 0,50 Buffer pH 5 (mL) 1,50 1,25 1,00 Fosfato 10 mM (mL) 0,50 0,50 0,50 INCUBAR 5 min. A 37° Enzima 0,5 mg/mL (mL) 0,50 0,50 0,50 9 10 0,75 1,00 0,75 0,50 0,50 0,50

0,50 0,50

Mezcle por inversion e incube 10 minutos a 37°. No olvide preparar inmediatamente 10 tubos que contengan 4,5 mL de NaOH 0,05 M. Pasados los 10 minutos de incubación a 37°, retire una alícuota de 0,5 mL adicionándoselas a los respectivos tubos que contengan 4,5 mL de NaOH 0,05 M. Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos. Confeccione las curvas pertinentes tanto en presencia como en ausencia de fosfato y determine los valores de Km y Vmax. Analizar y discutir los resultados según los objetivos