Clonagem molecular

Tópicos
Significado e objectivos da clonagem molecular
Etapas da clonagem molecular
Sistemas de clonagem em E. coli de fragmentos de diferentes dimensões
Sistemas de clonagem em E. coli de produção de DNA de cadeia simples
Preparação de bibliotecas genómicas
Preparação de bibliotecas de cDNA

Desenvolvimento da clonagem molecular

An Introduction to Genetic Engineering

Definição de clonagem molecular
A clonagem molecular é o processo de construção de moléculas de DNA recombinante e da sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a selecção do DNA recombinante.
Esta tecnologia permite estudar os genes e os seus produtos, obter organismos transgénicos e realizar terapia génica. …exibir mais conteúdo…

HhaI cliva a 3’ do eixo de simetria, originando extremidades coesivas, 3’OH projectadas.

As sequências de reconhecimento são, em geral, constituídas por quatro a seis pares de nucleótidos, e palindrómicas, isto é, quando lidas na mesma orientação em ambas as cadeias, 5’→3’ ou 3’→5’, são idênticas. A clivagem ocorre dentro da sequência de reconhecimento ou num local próximo.
As setas indicam os locais de corte e os símbolos a verde assinalam o eixo de simetria.

EcoRI e metilase EcoRI

As bactérias que produzem endonucleases de restrição também contêm as enzimas de modificação correspondentes que metilam bases no local de reconhecimento das endonucleases. A metilase EcoRI
(M.EcoRI) catalisa a adição de um grupo metilo a duas adeninas da sequência reconhecida por EcoRI.
A sequência metilada não é clivada por EcoRI, assegurando que o DNA da célula que produz esta enzima de restrição não é destruído.

Isosquisómeros
Reconhecem a mesma sequência e clivam nos mesmos locais
AccIII

T↓CCGGA
AGGCC↑T

e

BspE1 T↓CCGGA
AGGCC↑T

Estas enzimas geram extremidades compatíveis com XmaI C↓CCGGG
GGGCC↑C

Reconhecem a mesma sequência e clivam em locais diferentes
Acc65I G↓GTACC
CCATG↑G

e

KpnI

GGTAC↓C
C↑CATGG

XmaI C↓CCGGG
GGGCC↑C

e

SmaI

CCC↓GGG
GGG↑CCC

Reconhecem a mesma sequência e têm sensibilidades diferentes à metilação
DpnII e MboI