Metodos para manipulação de proteina.

907 palavras 4 páginas
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Métodos para manipulação de proteínas Cap 3 Lehninger pag.88

As proteínas podem ser separadas, purificadas, caracterizadas, quantificadas, seqüenciadas e até sintetizadas quimicamente.

A estrutura e função de muitas proteínas foram descobertas pela análise de proteínas isoladas

Objetivo: separar e determinar sua propriedade
• As células possuem milhares de diferentes espécies de proteínas. Como uma proteína pode ser purificada? ▫ Os métodos de purificação utilizam propriedades individuais de cada proteína:

 Tamanho
 Carga
 Propriedade de ligação (interações proteínaproteína ou proteína-ligando)

A fonte de proteína geralmente é o extrato bruto proveniente de células ou tecidos
• Devemos romper (lisar) as …exibir mais conteúdo…

• As proteínas com cargas contrárias as cargas da matriz sólida migram mais lentamente pela interação com a fase estacionária.
• Os dois tipos de proteínas são separadas em duas bandas diferentes. • Quanto maior o tamanho da coluna maior a resolução
(separação da amostra)

2.2. Cromatografia de exclusão (pelo tamanho)
• Fase estacionária constituída de poros com tamanhos definidos. • Proteínas menores entram dentro dos poros atrasando sua migração.

2.3. Cromatografia de afinidade
• Baseada na afinidade de ligação de uma determinada proteína à um ligante.
• A matriz sólida possui um grupo químico ligado covalentemente. • A proteína interagindo com o grupamento químico retarda sua migração.
• Ex:
▫ antígeno-anticorpo
▫ Biotina-estreptavidina
▫ Lectina e monossacarídeos
(manose ou glicose)
▫ Histidina tag e coluna de níquel, etc…

Extração da amostra
• Moer e pesar a amostra
• Misturar com sal e solução de metanol:água
• Filtrar

Diluição e filtração
• Diluir uma alíquota do extrato da amostra com água
• Filtrar
Cromatografia de afinidade
• Passar o filtrado pela coluna de imunoafinidade Afla B
• Passar água através da coluna
• Eluir as Aflatoxinas da coluna com metanol e recolher em uma cubeta

Seleção de proteínas totais ligante de DNA

Seleção de proteínas ligantes de sequências específicas (promotores)

HPLC: cromatografia

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