Enzimologia
1588 palavras
7 páginas
CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE QUÍMICAUNIDADE RIO DE JANEIRO
COORDENAÇÃO DE BIOTECNOLOGIA
BIOQUÍMICA (Laboratório 318)
CINÉTICA ENZIMÁTICA: a. CURVA PADRÃO DE PNP b. CURSO TEMPORAL c. INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA d. INFLUÊNCIA DO pH
e. CURVA DE SUBSTRATO f. INFLUÊNCIA DO INIBIDOR
Material:
Solução padrão de p-nitrofenol (PNP) 0,1 mM em tampão Tris-HCl pH 9,5
Solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 1 mM tampão Tris-HCl pH 9,5
Solução tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 7,5, 8,5 e 9,5
Solução de Na2HPO4 0,4 mM em tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 9,5 (sol. tampão Tris-Pi-HCl)
Soluções tampão borato-NaOH 0,3 M, pH 9,5, 10,5 e 11,5
Soluções tampão citrato HCl 0,2 M, pH 5,5, 6,5 e 7,5
Solução …exibir mais conteúdo…
7. Homogeneize os tubos com vigor, se preferir use o vortex.
8. Proceda a leitura espectrofotométrica da absorbância, a 405 nm, de cada um dos tubos, utilizando o tubo “branco” de cada um dos tampões como referência de calibração para o aparelho.
Tubo no
Solução tampão Citratato-HCl (mL)
Solução tampão
Tris-HCl (mL)
Solução tampão
Borato-NaOH (mL)
PNPP 1mM (mL)
ENZIMA (mL)
NaOH (mL)
Abs
405 nm nmoles de PNP
pH 5,5 pH 6,5 pH 7,5 pH 7,5 pH 8,5 pH 9,5
PH 9,5 pH 10,5 pH 11,5
B 1
2,0
1,0
0,2*
1,0
B 2
2,0
1,0
0,2*
1,0
B 3
2,0
1,0
0,2*
1,0
1
2,0
1,0
0,2
1,0
2
2,0
1,0
0,2
1,0
3
2,0
1,0
0,2
1,0
4
2,0
1,0
0,2
1,0
5
2,0
1,0
0,2
1,0
6
2,0
1,0
0,2
1,0
7
2,0
1,0
0,2
1,0
8
2,0
1,0
0,2
1,0
9
2,0
1,0
0,2
1,0
Obs1.: Note que o volume final de todos os tubos é rigorosamente o mesmo!
Obs2.: * - Nos tubos Brancos colocar a enzima somente depois da solução de NaOH.
d. Influência da temperatura
1. Transfira, com auxílio de pipeta e pró-pipete, alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo, exceto a solução de enzima e de NaOH:
2. Importante: pré-incube