Camundongos transgênicos

Animais transgênicos são aqueles que tiveram seu genoma alterado pelo recebimento de um gene de outra espécie. A tecnologia dos transgênicos permite inserir proteínas exógenas de interesse em camundongos e examinar as conseqüências. A técnica mais comum consiste na microinjeção direta do gene de interesse no pró-núcleo de ovos fertilizados. Uma micropipeta de vidro contendo a solução de DNA (~2 pmol) é introduzida no prónúcleo de um ovo fertilizado. Os embriões são cultivados e reimplantados em uma fêmea. Os filhotes que receberam o gene de interesse (no máximo 40% dos filhotes) são identificados por “Southern Blot”: o DNA dos animais é extraído e fragmentado; os fragmentos de DNA são separados por …exibir mais conteúdo…

Nos últimos, o gene-alvo não é expresso, permitindo o estudo dos efeitos no organismo da mutação KO.

Recombinação homóloga

Em geral, a recombinação homóloga envolve seqüências de DNA virtualmente idênticas: o vetor nocaute injetado tem suas extremidades alinhadas a regiões semelhantes no DNA do núcleo, as quais são cortadas, e em seguida acontece a troca.dos pedaços, com a religação das extremidades. O reconhecimento dessas extremidades é tão preciso que nenhuma alteração ocorre na seqüência das bases nucleotídicas nos sítios de ligação. Após a multiplicação celular, aplica-se neomicina na cultura. A grande maioria das células, nas quais não houve integração do vetor (aleatória ou por recombinação homóloga), continua sensível à droga e morre. Mas as que adquiriram o vetor e expressam o gene neor são resistentes à droga e permanecem vivas (seleção positiva). Também se pode ligar a uma extremidade do vetor outro marcador, como o gene da timidinaquinase (tk), enzima do vírus da herpes. Quando ocorre a recombinação homóloga, o gene tk não se integra ao DNA celular, por estar fora da seqüência similar que orienta o alinhamento entre o vetor e seu alvo. Mas se a integração é aleatória as células recebem o vetor inteiro. Nesse caso, a aplicação da droga ganciclovir é mortal para células que expressam o gene tk (seleção negativa). Com os dois marcadores (neor e tk), é possível selecionar