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Aula Prática IV
Eletroforese

1.INTRODUÇÃO

Eletroforese consiste na separação dos componentes de um sistema através de um campo elétrico. Substâncias em solução possuem carga elétrica livre, deslocam-se quando submetidas a um campo elétrico de sentido invariável (Heneine, 2003). É um método especialmente útil analiticamente, pode-se estimar o número de proteínas diferentes em uma amostra.
A eletroforese de proteínas geralmente é realizada em géis feitos de um polímero de acrilamida. O gel atua como uma peneira molecular, retardando a migração dos compostos aproximadamente na proporção de sua relação carga-massa (Nelson e Cox, 2011). As proteínas possuem cargas positivas e negativas, sendo sua …exibir mais conteúdo…

Os componentes estão descrito abaixo:
1 – Água – 2216,5 µL
2 – Acrilamida 30,0 g; Bis-Acrilamida 0,8g e água q.s.p. 100mL – 350 µL
3 – TRIS 36,3 g; HCl 1 M 48 mL; água q.s.p. 100 mL pH 8.8 – 375 µL
4 – SDS 10% – 30 µL
5 – Persulfato 10% – 22,5 µL
6 – TEMED 99% – 9 µL

Preparação da cuba vertical Após a preparação dos géis, as placas foram fixadas em cubas verticais. Adicionou-se o tampão Tris-glicina pH 8,6, diluído na porção de 1:10. Preparação e aplicação da amostra Para a corrida eletroforética, as amostras foram tratadas com tampão de amostra quatro vezes concentrado, contendo SDS 10%, DTT, tampão TRIS-HCl 1 M, glicerol, EDTA e EGTA. Após isso, aqueceu-se e centrifugaram-se as amostras e o sobrenadante foi aplicado nos poços do gel de empilhamento. Corrida eletroforética Depois da aplicação das amostras, conectou-se a cuba a uma fonte de corrente contínua de 20 mA (10mA no ínicio) e voltagem de 200 V. Coloração e descoloração Após a corrida, os géis foram retirados dos moldes e imersos numa solução fixadora de metanol, ácido acético e água durante 40 min (400:70:530 v/v). Em seguida foram colocados em uma solução corante de Comassie Blue R 250 durante três a quatro horas. Ao passar o período de coloração, o gel foi deixado em solução descorante de álcool etílico, acido acético e água (200:50:250 v/v), até a completa evidenciação das bandas. Além da coloração com Comassie Blue R250, o gel foi submetido