Metabolismo Bacteriano

1. Objetivos
2. Esterilización y
   desinfección
3. Técnicas de
   esterilización
5. Antibióticos

Las bacterias se
encuentran en casi todos los ambientes e intervienen en varios
procesos
biológicos. Por ejemplo, pueden producir luz, como en la
fosforescencia de los peces muertos
y pueden producir combustión espontánea en almiares,
pajares y graneros de lúpulo. Ciertas formas anaerobias
desprenden, por descomposición de la celulosa,
gas de los
pantanos en charcas estancadas; otras bacterias favorecen la
formación de depósitos de hierro ocre y
manganeso en los pantanos. Las bacterias también afectan a
la naturaleza y
composición del suelo.

Como resultado de su actividad, los restos de sustancias
orgánicas de las plantas y los
animales se
descomponen en partículas inorgánicas. Este
mecanismo es una fuente importante de alimento para las plantas.
El proceso
fotosintético en que se basan las plantas fue, casi con
certeza, desarrollado en primer lugar en las bacterias; el
reciente descubrimiento de una bacteria fotosintetizadora
denominada Heliobacterium chlorum puede ayudar a la
comprensión de este desarrollo
fundamental en la evolución de la vida.

Todos los seres vivos llevan a cabo el procesamiento de
los nutrientes que los mantienen vivos. A este conjunto de
procesos, se le conoce como metabolismo y
consiste de un gran número de reacciones
químicas destinadas a transformar las moléculas
nutritivas en elementos que posteriormente serán
utilizados para la síntesis
de los componentes estructurales; como pueden ser las proteínas.
Otra parte importante del metabolismo es la de transformar y
conservar la energía que está contenida en una
reacción química en
algún proceso que requiera de energía, como puede
ser el trabajo o
el movimiento.

Es evidente que los nutrientes son transformados cuando
entran en un organismo, ya que en ningún caso el alimento
contiene todas las moléculas que una célula
requiere. Esto se vio con claridad al observar el crecimiento
normal de levaduras en un medio de cultivo que sólo
contenía glucosa como
única fuente de energía. Así pues, se
pensó que la síntesis de todos los componentes
celulares se llevaba a cabo en el interior de las
levaduras.

Hoy sabemos que las transformaciones que sufre la
glucosa no ocurren en un solo paso, sino que, por el contrario,
se forman varios productos
intermedios que en muchas ocasiones no tienen una función
específica a no ser la de formar parte de lo que se conoce
como vía metabólica.
La transformación de los nutrientes en compuestos
útiles para la subsistencia de un organismo se lleva a
cabo por medio de las reacciones químicas que realizan
unas proteínas conocidas como enzimas.

Objetivos:

• Estudiar el metabolismo de tipos bacterianos
  representativos que reflejan los cambios producidos en la
  fermentación de la glucosa, lactosa,
  manitol, hidrólisis de urea, citrato, producción de sulfuro de hidrógeno, producción de indol, y
  la hidrólisis de proteínas
  (gelatina).
• Mostrar las vías metabólicas que varias
  especies tienen en común y que sirven de base para su
  diferenciación.

Procedimiento:

• Disponer los tubos en las gradillas y rotularlos con
  el nombre del microorganismo.
• Inocular cada tubo con uno de los cultivos,
  procurando hacerlo con el asa indicada y de la forma indicada
  (punta sin mover, superficial, picadura, etc.)
• Incubar a 37ºC por 18 hrs. y luego leer los
  resultados.

Resultados:

Conclusiones:

• Como podemos notar en la tabla de resultados todos
  los microorganismos son tolerantes a la glucosa y son capaces
  de fermentarla.
• En la reacción con lactosa no todos los
  microorganismos la fermentan, podemos notar que algunos liberan
  gas que es el hidrogeno.
• En la prueba del citrato la realizamos también
  para comprobar si los microorganismos podían utilizar el
  citrato como única fuente de carbono,
  provoca alcalinización del medio.
• En la prueba con el agar manitol ya que este presenta
  rojo fenol que es un indicador de pH solo
  tendría que reaccionar con Staphylococcus aureus ya que
  es uno de los microorganismos que fermenta el
  manitol.
• En la prueba con el agar urea podemos notar que el
  único microorganismo que reacciona es el Proteus
  vulgaris ya que este produce ureasa que es la enzima que
  permite hidrolizar la urea.

Esterilización
y desinfección

La esterilización es el proceso mediante el cual
se alcanza la muerte de
todas las formas de vida microbianas, incluyendo bacterias y sus
formas

esporuladas altamente resistentes, hongos y sus
esporas, y virus. Se
entiende por muerte, la
pérdida irreversible de la capacidad reproductiva del
microorganismo. Se trata de un término absoluto, donde un
objeto está estéril o no lo está, sin rangos
intermedios.

En la desinfección se eliminan los agentes
patógenos reconocidos, pero no necesariamente todas las
formas de vida microbianas. Es un término relativo, donde
existen diversos niveles de desinfección, desde una
esterilización química, a una mínima
reducción del número de microorganismos
contaminantes. Estos procedimientos se
aplican únicamente a objetos inanimados.

La antisepsia es el proceso que por su baja toxicidad,
se utiliza para la destrucción de microorganismos
presentes sobre la superficie cutáneo-mucosa. Este
término tampoco implica la destrucción de todas
las

formas de vida. Existen agentes como los alcoholes que
son antisépticos

y desinfectantes a la vez. Dado que el tema que se
está abordando es: métodos
para controlar o destruir distintas poblaciones bacterianas; es
necesario saber previamente la cinética de dicha
destrucción, es decir de que modo muere una población, y que parámetros inciden
sobre este efecto.

Técnicas
de esterilización

1. Destrucción de microorganismos mediante
   calor:

La energía térmica es la forma más
efectiva de esterilización. Esta puede utilizarse como
calor húmedo o seco.

1. Mecanismo de Acción: Al igual que los procesos
   de desinfección, la esterilización
   térmica destruye a los microorganismos en forma
   gradual; es por esto que no hay un único mecanismo de
   acción, sino más bien la suma de distintos
   eventos
   complejos que se van sucediendo a medida que aumenta la
   temperatura. Así, aunque el efecto
   final de la esterilización por calor húmedo a
   121ºC es la desnaturalización y
   coagulación de las proteínas, son importantes
   otros mecanismos de destrucción, que justifican la
   utilización de calor húmedo a temperaturas
   inferiores, como veremos más adelante. El primer
   efecto letal sería la producción de rupturas de
   cadena única en el ADN que
   provocarían la muerte celular por activación o
   liberación de enzimas con actividad de
   endonucleasas.

   El punto crítico aquí, para la
   supervivencia de la
   célula sería su capacidad para reparar la
   lesión, función que depende del estado
   genético y fisiológico de la bacteria. A medida
   que aumenta la temperatura se agregaría la
   pérdida de la integridad funcional de la membrana
   citoplásmica, lo que produciría interferencias
   en el intercambio con el medio externo, los procesos
   respiratorios y la síntesis proteica. Por
   último, las temperaturas más elevadas
   activarían ribonucleasas que degradando el ARNr
   producen la pérdida de viabilidad de las células expuestas. Las temperaturas a
   la cual puede usarse el calor húmedo son:

   Por debajo de
   100ºC→Pasteurización.

   A 100ºC → Ebullición y
   Tindalización

   Por encima de 100ºC →
   Autoclavado

   

   Pasteurización: se utiliza para la
   destrucción de gérmenes patógenos, con
   resistencia térmica similar o inferior
   a M. tuberculosis, Brucella y
   Salmonella. Este no es un método de esterilización sino de
   desinfección, donde no se destruyen ni esporas ni
   virus no lipídicos (por Ej.: HAV).

   Existen dos métodos de pasteurización:
   o se calienta a 65ºC durante 30' o a 72ºC durante
   15". Luego ambas se enfrían rápidamente a
   10ºC.

   Esta técnica se utiliza fundamentalmente en
   la descontaminación de la leche.

   

   Ebullición: consiste en mantener un
   objeto o sustancia en un baño a 100ºC durante
   30'. Aplicado así destruye la mayoría de las
   formas vegetativas bacterianas, hongos y virus
   lipídicos (por Ej.: Herpesvirus y HIV). En cambio no
   es efectivo para la destrucción de esporos y virus no
   envueltos. La repetición de este proceso durante tres
   días consecutivos, constituye la
   Tindalización. Su fundamento teórico
   está dado por la destrucción de las formas
   vegetetivas durante los períodos de ebullición,
   permitiendo que las esporas germinen durante el reposo
   volviéndose susceptibles al próximo
   calentamiento. Tampoco aquí se esteriliza.

   

   Autoclavado: utiliza vapor de agua a
   121ºC durante 15'o 20'. Esta temperatura se logra si se
   obtiene una presión de una atmósfera relativa (dos
   atmósferas absolutas), ya que el aumento de la
   presión provoca aumentos proporcionales en el punto de
   ebullición del agua. Es el mecanismo de
   destrucción microbiana más efectivo, y bien
   utilizado asegura esterilización. El equipo que se
   utiliza es la autoclave, del cual existen distintos
   tipos, como ser:

   1. Vertical de manejo manual.

   2. Que opera por gravedad.

   3. De esterilización
   rápida.

   

2. Calor húmedo:
3. Calor seco:

Mecanismo de acción: Es diferente al del
calor húmedo. El calor seco provoca
desnaturalización de proteínas, lesiones por
oxidación y efectos tóxicos por niveles elevados de
electrolitos. La acción letal es el resultado del calor
trasmitido desde el material con el cual los microorganismos
están en contacto, y no desde el aire caliente que
los rodea. Existen tres formas principales de
esterilización por calor seco: flameado,
incineración y mediante la utilización del
horno Pasteur, para ello se necesita alcanzar mayor
tiempo y
temperatura que en el autoclave, debiéndose mantener un
objeto a 160ºC durante 2hs. El motivo de estos incrementos
estarían dados porque la ausencia de agua
disminuiría el número de grupos polares de
las cadenas peptídicas, lo que daría mayor
estabilidad a las moléculas bacterianas, por lo que se
requeriría mayor energía para abrirlas.

Horno Pasteur O Poupinell: consiste en un recinto
metálico de doble pared con aislante entre ambas (para
evitar la pérdida de calor) y una puerta. La fuente de
calor suele ser eléctrica y está incorporada. Posee
un ventilador que facilita la circulación del aire
caliente, para homogeneizar la temperatura. Un termómetro (con alcance mínimo de
200ºC) visible desde afuera, registra la temperatura del
interior del recinto. Por calor seco se pueden esterilizar:
materiales de
inyectables, vidrios, instrumentos quirúrgicos y objetos
metálicos, así como aceites, vaselinas y polvos,
que como ya se ha dicho son impermeables al vapor.

Controles de esterilización:

Existen tres tipos: físicos, químicos,
biológicos

Controles físicos: están
relacionados al operario que realiza el procedimiento y
la vigilancia de ciertos parámetros como: presión,
tiempo, temperatura, etc.

Controles químicos: consiste en tiras de
papel con una sustancia que cambia de color al ser
expuesto a la temperatura correspondiente. La ventaja de este
método, es la rapidez con que se sabe el resultado, ya que
es inmediato. La gran desventaja es que dice poco sobre el tiempo
de exposición, por lo que no asegura un
procedimiento correcto. Estos controles deben utilizarse en todos
los ciclos de esterilización.

Controles biológicos: consisten en exponer
esporas bacterianos al ciclo de esterilización y luego
verificar su viabilidad. Son los más seguros. Dentro
de una ampolla se encuentra un medio de cultivo apropiado para el
desarrollo de las bacterias en estudio. Por fuera de esta, un
tubo plástico,
contiene una cinta de papel marcador de pH, impregnado con
esporas de bacterias capaces de resistir temperaturas cercanas a
los procesos realizados. Se utilizan esporas de Bacillus
estearothermophilus en el autoclave y de B. subtilis
en la poupinell.

Este sistema se coloca
dentro del paquete menos accesible ya sea para el calor o el
vapor. Finalizado el ciclo de esterilización, se rompe la
ampolla (por presión manual sobre el tubo), esto pone en
contacto el medio con los esporos) y se incuba en un baño
(a 60ºC para Bacillus

estearothermophilus y a 37ºC para B.
subtilis) durante más de 48hs. Si existen
microorganismos viables, su metabolismo provocará un
cambio de pH que hará virar el color del marcador,
revelando el fallo del procedimiento, por lo que deberá
volverse a esterilizar todo.

Este tipo de controles debe realizarse
periódicamente, o cuando se dude de la efectividad del
procedimiento.

1. Con este fin pueden utilizarse tanto las radiaciones
   ultravioletas (UV) como las ionizantes y rayos infrarrojos.
   Con respecto a la naturaleza de la luz se acepta una
   combinación entre la teoría cuántica y la
   electromagnética. Es decir, que existe una
   partícula indivisible (denominada cuanto) constituida
   por un fotón que se desplaza a través del
   espacio describiendo una trayectoria ondulatoria. La
   energía de un fotón es inversamente
   proporcional a la longitud de onda de la radiación, sabiendo que longitud de
   onda es la distancia que existe entre dos puntos
   correspondientes de la trayectoria ondulante. Parte de esta
   energía absorbida por los sistemas
   biológicos cuando estos son expuestos a las
   radiaciones. La fracción de energía absorbida
   directamente proporcional a la intensidad de la
   radiación, al tiempo de exposición a la misma y
   a un coeficiente de absorción que es
   característico de cada material.

   Veremos qué sucede a nivel molecular cuando
   las radiaciones interactúan con la materia.
   Cuando la radiación incidente tiene energía
   suficiente puede elevar el nivel energético de los
   electrones, hasta el punto de arrancarlos de su orbital
   (produciéndose ionizaciones). Si la energía es
   menor, los electrones aumentan su nivel de energía
   pero sólo temporalmente, volviendo a su estado inicial
   luego de un período de tiempo. Este estado elevado de
   energía se denomina estado excitado. La
   molécula excitada podrá transferir ese exceso
   de energía otras, en forma de energía
   vibratoria (produciéndose calor); o disiparla en forma
   de radiación electromagnética. Debido a la
   relativamente baja cantidad de energía que son capaces
   de transmitir los rayos UV, sólo afectan a los
   electrones de los átomos periféricos de las moléculas,
   produciéndose solo estados de excitación. Las
   radiaciones ionizantes son las que pueden extraer
   electrones de sus orbitales. Los rayos infrarrojos
   sólo pueden provocar energía vibratoria, por lo
   que sólo generan calor. Hablaremos a
   continuación solamente de las radiaciones UV ya
   que son las más utilizadas en nuestros
   laboratorios. Se sabe que las radiaciones ionizantes son cada
   vez más utilizadas en los laboratorios como técnicas de esterilización de
   rutina, ya que los adelantos tecnológicos han
   simplificado estos equipos y su manipulación. Se
   utilizan para la esterilización de materiales
   descartables como jeringas, agujas, materiales para
   vías, etc.

   

   Radiaciones UV:

   Mecanismo de acción: el principal
   mecanismo del efecto letal de la luz UV sobre las bacterias,
   se atribuye a su absorción por el ADN y el resultante
   daño de este. Así provocan la
   formación de uniones covalentes entre los residuos de
   pirimidina adyacentes pertenecientes a la misma cadena, lo
   que provoca la formación de dímeros de
   pirimidina de tipo ciclobutano.

   Esto produce distorsiones en la forma del DNA e
   interfiere en el apareamiento normal de las bases. El
   resultado final es la inhibición de la síntesis
   de ADN y secundario a esto, inhibición del crecimiento
   y la respiración.

   Aplicaciones: estas radiaciones pueden
   producirse artificialmente con lámparas de vapor de
   mercurio. Son igualmente efectivas para Gram(+) y Gram(-). Su
   principal uso es para esterilizar el aire y superficies, ya
   que no penetran en sólidos y lo hacen pobremente en
   líquidos.

2. Esterilización por
   radiación
3. Esterilización por medios
   mecánicos:

Filtración

Es el método usado en el laboratorio
para esterilizar líquidos termolábiles.

Existen distintos tipos de filtros: de asbesto-celulosa,
de vidrio, de
cerámica y de ésteres de celulosa o
membranas. Las membranas están compuestas por
ésteres de celulosa biológicamente inertes. Los
poros varían desde 0.025 µm. a 25 µm. de
diámetro, siendo los de 0.22µm. los más
utilizados ya que son lo suficientemente pequeños para
detener a todas las bacterias. Con este método se
esterilizan: azúcares, urea, sueros, antibióticos,
etc.

Los filtros de membrana también se utilizan en
Microbiología para otros propósitos.
Dado que son inertes, proporcionan un buen medio para recoger
microorganismos, por ejemplo para cultivar bacterias que se
encuentran en bajas concentraciones en un gran volumen de
líquido. El mecanismo de acción es bastante simple:
detienen todas las partículas que posean un tamaño
mayor que los poros. En realidad los "poros" quedan formados por
los espacios que resultan de la superposición de las
fibras de las distintas capas que forman la membrana. Así,
algunas partículas de menor tamaño son retenidas
por otros mecanismos como las fuerzas de Van der Waals o por suma
de partículas retenidas previamente, etc. por lo cual "el
tamaño del poro" es un valor virtual
definido por el tamaño de la partícula retenida,
más que por un diámetro real medible.

Aplicación de calor
húmedo

Objetivo:

• Mostrar la efectividad del calor húmedo en la
  esterilización de cultivos bacterianos.
• Comprobar el efecto de las diferentes temperaturas en
  los cultivos bacterianos.

Procedimiento:

• Rotular las placas con agar nutritivo y los tubos de
  Thioglicolato de acuerdo al diseño
  gráfico indicando los tiempos y temperaturas a los
  que serán expuestos.
• Inocular 2 a 3 gotas del cultivo bacteriano escogido
  en el tubo Thioglicolato Nº 9, a partir del cual inocular
  el cuadrante 0 de la placa Nº 1 e igualmente los 4 tubos
  correspondientes para la exposición a 55ºC. Colocar
  los tubos en el baño María de 55ºC, e
  iniciar el conteo del tiempo de acción del calor
  húmedo; inoculando a los 5, 10 y 30 minutos los
  cuadrantes de la placa correspondiente. De igual manera
  proceder con la placa Nº 2 y los tubos que serán
  expuestos a 100ºC.

• Colocar las placas Nº 1 y Nº 2 y los tubos
  inoculados en la incubadora a 37ºC entre 18 – 24
  horas. Después de este período realizar la
  lectura del
  desarrollo microbiano en los cuadrantes de las placas y los
  tubos.

Resultados:

• El signo positivo (+) indica que si hubo crecimiento,
  por el contrario el signo negativo (-) significa que no hubo
  crecimiento.

Placa Nº 1 expuesta a
55ºC

Placa Nº 2 expuesta a
100ªC

Conclusiones:

• El hecho de que haya crecimiento se debe a la
  tolerancia
  de cada microorganismo al calor.
• El crecimiento en la placa no es igual al crecimiento
  que se da en el tubo.
• El primer efecto letal a la exposición al
  calor húmedo es la producción de rupturas de
  cadena única en el ADN que provocan la muerte celular
  por activación o liberación de enzimas con
  actividad de endonucleasas.
• Las bacterias podrian sobrevivir dependiendo de su
  capacidad para reparar la lesión, esta función
  depende del estado genético y fisiológico de la
  bacteria. A medida que aumenta la temperatura se agrega la
  pérdida de la integridad funcional de la membrana
  citoplásmica, lo que produciría interferencias en
  el intercambio con el medio externo, los procesos respiratorios
  y la síntesis proteica.

Aplicación del calor seco

Objetivo:

• Mostrar la efectividad del calor seco como
  método de esterilización de material
  contaminado.

Procedimiento:

• Rotular cada tubo estéril, con la temperatura
  y el tiempo de exposición correspondiente.
• En cada uno de los 8 tubos colocar papel filtro
  impregnado.
• El 9º disco de papel filtro impregnado colocarlo
  en el 9º tubo de Thioglicolato y en el 10ª tubo,
  coloque un disco de papel filtro sin impregnar.
• Una vez identificados los discos y en posición
  correlativa se les expone al calor seco a 150ºC y
  175ºC respectivamente a diferentes períodos de
  tiempo.
• Terminada la exposición a las temperaturas y
  tiempos indicados se extraen los tubos del horno esterilizador
  y se vierte en ellos el caldo Thioglicolato
  correspondiente.
• Incubar a 37ºC por 18 – 24 horas y anotar
  los resultados obtenidos al día siguiente en la tabla de
  resultados.

Resultados:

Conclusiones:

• El calor seco provoca desnaturalización de
  proteínas, lesiones por oxidación y efectos
  tóxicos por niveles elevados de
  electrolitos.
• Es un error ver crecimiento de E. Coli ya que este
  microorganismo no soporta temperaturas elevadas.
• B. subtilis es más resistente que el resto de
  microorganismos debido a que es esporulado y la espora es
  termorresistente.

Aplicación de la Luz UV

Objetivos:

• Demostrar la efectividad y limitaciones de la luz
  ultravioleta.

Procedimiento:

• Sembrar en la superficie de las placas petri con agar
  Tripticase, los microorganismos indicados, empleando para ello
  el hisopo estéril, dejar secar.
• Para la siembra en Pour Plate utilizar los tubos con
  agar licuado e inocular en cada uno 100 μL del cultivo
  seleccionado, mezclar por rotaciσn y verter
  el contenido en cada una de las placas petri rotuladas con el
  nombre del cultivo utilizado y dejar solidificar.
• Dividir las placas de siembra en superficie y las de
  Pour Plate en cuatro cuadrantes y rotular cada cuadrante con
  los tiempos de exposición siguiendo el sentido de las
  agujas del reloj: 30 seg. , 2 y 5 minutos.
• Exponer las placas a la luz UV de acuerdo al tiempo
  rotulado en cada placa cubriendo las partes de la placa que no
  deben de ser expuestas.
• Incubar 18 – 24 horas a 37ºC y luego
  anotar los resultados.

Resultados:

• El número de signos
  indica el volumen de crecimiento del
  microorganismo.

Conclusiones:

• En el caso de la placa en donde solo se sembro en la
  superficie la luz UV mató a los
  microorganismos.
• En la placa vertida o Pour Plate debido a que la luz
  UV no atraviesa superficies no pudo matar a aquellos
  microorganismos que se encontraban más
  profundos.
• El principal mecanismo del efecto letal de la luz UV
  sobre las bacterias, se atribuye a su absorción por el
  ADN y el resultante daño de este. Así provocan la
  formación de uniones covalentes entre los residuos de
  pirimidina (timina) adyacentes pertenecientes a la misma
  cadena, lo que provoca la formación de dímeros de
  pirimidina de tipo ciclobutano, esto produce distorsiones en la
  forma del DNA e interfiere en el apareamiento normal de las
  bases. El resultado final es la inhibición de la
  síntesis de ADN y secundario a esto, inhibición
  del crecimiento y la respiración.

Desinfección química

Objetivos:

• Comparar la efectividad de varios compuestos
  químicos in vitro sobre diferentes tipos de bacterias y
  diferentes diluciones.

Procedimiento:

• Colocar el desinfectante y los tres tubos con agua,
  rotularlos como Nº1, Nº2 y Nº3, colocarlos en
  una gradilla. Preparar diluciones de 1:5, 1:25 y 1:125 del
  desinfectante transfiriendo 1 ml. del desinfectante al tubo de
  agua Nº1, luego de mezclar transferir de este tubo 1 ml.
  al tubo de agua Nº2, luego de mezclar transferir 1 ml. de
  este tubo al tubo de agua estéril Nº3 descartando 1
  ml. del último tubo.
• Pipetear 0.5 ml. del cultivo a cada uno de los tubos
  anteriores.
• Después de 5 y 15 minutos de
  exposición, extraer 300 μl. de cada uno de los tubos
  preparados en el paso anterior y colocar en tubos de caldo
  Thioglicolato; rotular cada tubo de acuerdo a la
  dilución y el tiempo al que corresponden.
• Luego incubar a 37ºC por 24 horas y luego anotar
  los resultados en las tablas de anotación.

Resultados:

Diluciones

Escherichia Coli

Conclusiones:

• Puede concluir que en diluciones más altas hay
  mayor crecimiento bacteriano, debido a que el desinfectante a
  mayor dilución pierde su eficacia.

Cuestionario

1. Comparar la eficacia del calor seco y del calor
   húmedo como medios de
   esterilización.

En ambos casos la utilización del calor y su
eficacia dependen de dos factores: el tiempo de exposición
y la temperatura.
Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a
la acción del calor. El calor provoca
desnaturalización de proteínas, fusión y
desorganización de las membranas y/o procesos oxidantes
irreversibles en los microorganismos.

Calor Húmedo:
Produce desnaturalización y coagulación de
proteínas. Estos efectos se debe principalmente a dos
razones:
– El agua es una
especie química muy reactiva y muchas estructuras
biológicas son producidas por reacciones que
eliminan
agua
– El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor
mucho más elevado que el aire.

Ventajas:

• Rápido y sencillo ya que el vapor penetra
  rápidamente en los materiales porosos.
• Destrucción de bacterias y esporas en corto
  tiempo.
• No es tóxico ni deja residuos.
• Hay un bajo deterioro del material
  expuesto.
• Precios bajos del producto
  final.
• Desinfección, la esterilización
  térmica destruye a los microorganismos en forma gradual;
  es por esto que no hay un único mecanismo de
  acción, sino más bien la suma de distintos
  eventos complejos que se van sucediendo a medida que aumenta la
  temperatura.
• Mayor gama de productos a esterilizar que con calor
  seco material textil, materiales duros, jeringas y agujas,
  vidrios, líquidos hidrosolubles.

Desventajas:

• No permite esterilizar soluciones
  que formen emulsiones con el agua.
• Es corrosivo sobre ciertos instrumentos
  metálicos.
• Temperaturas elevadas.
• Altera ciertos materiales como plásticos y caucho.
• Corrosión de objetos metálicos con
  deterioro de filos.
• Imposibilidad de esterilizar polvos, aceites y
  grasas.

Calor seco:
El calor seco produce desecación de la célula, es
esto tóxicos por niveles elevados de electrolitos,
fusión de membranas. Estos efectos se deben a la
transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos
que están en contacto con éstos.
La acción destructiva del calor sobre proteínas y
lípidos
requiere mayor temperatura cuando el material está seco o
la actividad de agua del medio es baja.

Ventajas del calor seco:

• No es corrosivo para metales e
  instrumentos.
• Permite la esterilización de sustancias en
  polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no
  volátiles.
• El calor seco (o desecación en general)
  provoca desnaturalización de proteínas, lesiones
  por oxidación y efectos tóxicos por niveles
  elevados de electrolitos.
• La acción letal es el resultado del calor
  trasmitido desde el material con el cual los microorganismos
  están en contacto, y no desde el aire caliente que los
  rodea.
• Se aplica a líquidos y sustancias liposolubles
  e hidrófugas (aceites, parafinas, vaselinas, cremas
  etc.)
• Se aplica a instrumentos cortantes (bisturís,
  tijeras, etc.)

Desventajas:

• Requiere mayor tiempo de esterilización,
  respecto al calor húmedo, debido a la baja
  penetración del calor.

1. El DNA de una célula procariote sufre
   lesiones espontáneas debido a la
   depurinización, desaminación,
   alquilación y oxidación de los
   nucleótidos o al efecto de la radiación UV. Sin
   embargo, en las células vegetativas estos daños
   son rápidamente reparados por efectivos sistemas
   enzimáticos. En cambio, las esporas bacterianas no
   presentan actividad enzimática pero son resistentes
   gracias al bajo contenido de agua que retarda o altera las
   reacciones químicas que afectan al DNA. Este menor
   contenido de agua disminuye la tasa de depurinización
   y ka fotoquímica del DNA frente al UV respecto a las
   de una célula vegetativa. El DNA de la espora se
   encuentra unido a unas proteínas denominadas
   alfa/beta-SASP que disminuyen el daño térmico
   del DNA. La termorresistencia de las endósporas es una
   de sus principales características. Mientras que las
   bacterias o las formas vegetativas de las bacterias
   esporuladas sometidas a 80 ºC durante diez minutos
   (pasteurización) mueren, las endósporas
   sobreviven e incluso soportan un calentamiento superior. Para
   eliminarlas son necesarias técnicas de
   esterilización.

2. Comparar la resistencia al calor de las
   células vegetativas con las esporas
   bacterianas.

   El punto térmico mortal o letal: es la
   temperatura mínima que mata a todas las bacterias en
   un tiempo determinado, el tiempo de referencia empleado es de
   10 min.

   El tiempo térmico mortal: es el tiempo
   mínimo requerido para que mueran todas las bacterias
   de una determinada suspensión a una determinada
   temperatura.

3. Establecer la diferencia entre los
   términos: punto térmico letal y tiempo
   térmico letal.
4. Enumerar las principales condiciones que influyen
   en la actividad antimicrobiana de los agentes
   químicos.

• Actúan sobre microorganismos en cualquier
  estadío metabólico (en multiplicación o
  no).
• Se caracterizan por actuar inclusive sobre los
  esporos bacterianos (forma más resistentes dentro de los
  microorganismos), produciendo una esterilización
  química si el tiempo de acción es el
  adecuado.
• Los desinfectantes de alto nivel actúan
  modificando en forma irreversible grupos funcionales de
  proteínas y/o ácidos
  nucleicos. Entre otros efectos, esto provoca inhibición
  enzimática, lo que lleva a la muerte celular. Los
  agentes que predominan en este grupo son
  los Alquilantes (Oxido de etileno, formaldehído,
  glutaraldehído).
• Buena tolerancia local para la piel humana,
  las mucosas y la superficie de heridas.
• Acción rápida.
• Lesionan la membrana celular.
• Inactivan irreversiblemente la
  proteína.
• Lesionan ácidos nucleicos.
• Eficaz en materia orgánica.
• Poder de penetración conveniente en las
  grietas de los tejidos.
• Solubilidad y estabilidad.

1. COMPUESTOS FENOLICOS:

   Actúan rápidamente, se combinan con
   las proteínas, coagulándolas a altas
   concentraciones (acción germicida), actuando en forma
   inespecífica como un veneno protoplasmático,
   producen un desordenamiento estructural de la membrana
   citoplásmica, que interfiere con su funcionamiento
   normal. Esto provoca la pérdida de pequeños
   metabolitos del medio intracelular y dificulta tanto el
   transporte
   activo como el metabolismo energético, la
   activación en forma irreversible de las oxidasas y
   deshidrogenasas que se encuentran unidas a la membrana. El
   fenol (ácido carbólico) como tal, ya no es
   utilizado más que como patrón para comparar
   otros desinfectantes. Esto es debido a su alta toxicidad,
   carcinogenicidad y su poder
   corrosivo. La sustitución de uno de los
   hidrógenos del núcleo fenólico por
   grupos funcionales tales como alquilo, difenilo, fenil y
   cloro, disminuye notablemente los efectos adversos y aumenta
   la actividad antibacteriana de estos compuestos. La
   unión de estos fenoles modificados a jabones aumentan
   aún más su acción, a la vez que los
   hidrosolubilizan. Dentro de las sustituciones más
   utilizadas se encuentran los alquilo fenoles
   (cresoles) y los compuestos difenílicos
   (hexaclorofenol). Los compuestos fenólicos
   utilizados en las concentraciones adecua-das y con el tiempo
   suficiente son: bactericidas, virucidas y fungicidas; por Ej:
   el HIV es inactivado por una solución fenólica
   al 0.5%, mientras que se necesita una solución al 2%
   para inactivar hongos. Por lo general la concentración
   utilizada oscila entre 2 y 5%.

   CRESOLES:

   Se los divide en tres grupos: orto meta y
   paracresol, aunque suele utilizarse una mezcla de los tres
   denominada tricresol. Derivados de la destilación del alquitrán de
   hulla son mezclados con jabón y se comercializan por
   Ej.: como Creolina. Esta se utiliza para desinfección
   ambiental por Ej.: paredes, pisos, etc.

   HEXACLOROFENOL:

   Es un derivado halogenado con gran acción
   bactericida, fundamentalmente sobre bacterias Gram (+), sobre
   todo estrepto y estafilococos.

   Posee acción persistente, hasta el punto que
   su máxima acción bactericida se manifiesta
   luego de varios días de uso consecutivo.

2. Comparar la capacidad germicida del fenol con la
   de otros desinfectantes de tipo
   fenólico.
3. ¿Cómo podría demostrar la
   actividad antimicrobiana de una pomada
   antiséptica?

Existen tres métodos para demostrar la actividad
antimicrobiana de una pomada antiséptica. La primera es
usando la técnica de diluciones del agente químico.
También se puede usar la técnica del coeficiente
fenólico que es una técnica estandarizada que se
utiliza para comparar el poder antiséptico de un agente
químico frente al del fenol. Es una modificación de
la técnica de dilución en tubo. Finalmente se puede
hacer uso de la técnica de la placa de agar en donde se
inocula una placa que contenga medio de cultivo sólido con
el microorganismo utilizado como prueba. El agente químico
se coloca en el centro de la placa, bien dentro de un cilindro o
impregnado en un disco de papel. Al cabo de 24 a 48 horas se
observan zonas de inhibición (crecimiento) alrededor del
agente químico. Una modificación de esta
técnica es la incorporación del agente
químico en el medio de cultivo antes de verterlo sobre la
placa. Una vez solidificado se inocula con el microorganismo
utilizado como prueba, se incuba y se examina el crecimiento
microbiano llevando a lo que se realizo en el laboratorio, se
utilizó como método de demostración la
introducción de un hisopo en el caldo
tripticase con una de las bacterias que contenía una
concentración bacteriana equivalente al tubo, luego
ésta fue diseminada uniformemente sobre la superficie de
la placa con agar. Con pinzas se colocó los discos con
pomada antiséptica en la placa, se incubó a
37ºC de 18 a 24 horas. Finalmente se observaría si
hubo o no crecimiento
bacteriano lo que indicaría el poder del agente
antiséptico sobre la bacteria.

Antibióticos

Los antibióticos, o agentes antimicrobianos, son
sustancias (obtenidas de bacterias u hongos, o bien obtenidas de
síntesis química) que se emplean en el tratamiento
de infecciones.

La elección de uno u otro antibiótico en
el tratamiento de una infección depende del microorganismo
(obtenido por cultivo o supuesto por la experiencia), de
la sensibilidad del microorganismo (obtenida por un antibiograma
o supuesta por la experiencia), la gravedad de la enfermedad, la
toxicidad, los antecedentes de alergia del paciente y el costo. En
infecciones graves puede ser necesario combinar varios
antibióticos.

La vía de administración puede ser oral
(cápsulas, sobres), tópica (colirios, gotas, etc.)
o inyectable (intramuscular o intravenosa). Las infecciones
graves suelen requerir la vía intravenosa.

Los antibióticos actúan a través de
2 mecanismos principales: Matando los microorganismos existentes
(acción bactericida), e impidiendo su reproducción (acción
bacteriostática). Su mecanismo de acción
predominante los divide en 2 grandes grupos:

Bactericidas

• Beta-lactámicos (Penicilinas y
  cefalosporinas)
• Glicopéptidos (Vancomicina,
  teicoplanina)
• Aminoglucósidos (Grupo
  estreptomicina)
• Quinolonas (Grupo norfloxacino)
• Polimixinas

Bacteriostáticos

• Macrólidos (Grupo eritromicina)
• Tetraciclinas
• Cloramfenicol
• Clindamicina, Lincomicina
• Sulfamidas

El primer objetivo del
antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa
bacteriana que se sospecha es la responsable de una
infección a uno o varios antibióticos. En efecto,
la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la
eficacia in vivo de un tratamiento antibiótico. El
antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones
terapéuticas individuales.

El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la
evolución de las resistencias
bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiológico, a
escala de un
servicio, un
centro de atención médica, una región o
un país, es como puede adaptarse la antibioterapia
empírica, revisarse regularmente los espectros
clínicos de los antibióticos y adoptarse ciertas
decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de
prevención en los hospitales.

Hay pues un doble interés:
Terapéutico y epidemiológico.

Susceptibilidad antibiótica

Objetivo:

• Mostrar in vitro la susceptibilidad de diferentes
  bacterias a ciertos antibióticos.

Procedimiento:

• Introducir el hisopo estéril en el tubo que
  contiene la bacteria en este caso Pseudomonas, diseminar
  uniformemente sobre la superficie del agar Mueller Hinton.
  Proceder igual para los otros cultivos bacterianos.
• Rotular las placas trabajadas con el nombre de la
  cepa de la bacteria usada.
• Con la ayuda de una pinza colocar los discos de
  antibióticos en forma adecuada y similar para cada cepa.
  La distancia de separación entre cada disco no debe ser
  menor a 2 cm.
• Incubar a 37ºC durante 18 – 24
  horas.
• Luego realizar la lectura
  con ayuda de una regla milimetrada, midiendo el diámetro
  del halo de inhibición presente alrededor del disco de
  cada antibiótico.

Resultados:

Conclusiones:

• Podemos notar que la Pseudomona es resistente al
  cloranfenicol.
• Se puede comprobar que la resistencia y la
  susceptibilidad del microorganismo al antibiótico esta
  relacionado al halo que se forma.

Autor:

Chriss Malca Bautista

Email:

Estudios Pregrado en Estomatología –
Microbiología oral