Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica.

Este procedimiento es crítico y necesario para realizar los cualquier estudio funcional de células mononucleares (monocitos, macrófagos, células NK y linfocitos T y B). El aislamiento de éstos se puede hacer a partir de muestras de sangre periférica, órganos linfoides u otros tejidos. Este aislamiento se puede realizar por varios métodos pero en esta ocasión vamos a hacer referencia a la “Separación por gradiente de densidad”, utilizaremos la centrifugación sobre una solución de densidad definida como es el Ficoll-Hypaque.

El Ficoll es un polímero de carbohidrato y metrizamida (compuesto denso que contiene yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos y los granulocitos …ver más…

17. Completar nuevamente hasta los 15 mL con suero fisiológico, cubrir tubo y llevar nuevamente a centrifugar igual que en el paso anterior.
18. Centrifugar con contrapeso a 1500 r.p.m. durante 10 minutos, a 4ºC pudiendo utilizar freno al final de la centrifugación.
19. Decantar sobrenadante y resuspender células del fondo con un pulso de vórtex o con golpes con las yemas de los dedos.
20. Agregar 2 mL de suero fisiológico, cubrir tubo y agitar para resuspender células en el medio de cultivo.
21. Contar células.
Finalmente en el conteo de células es un paso importante porque es necesario tener ajustado el número de células a una cantidad de fija. Convencionalmente se ajustan a un millón de células por mL, el conteo se realiza en cámara de Neubabuer y con Azul de Tripano. Luego de tener ajustado el número de células se procede al cultivo de las células mononucleares para poder realizar los estudios funcionales de estos tipos celulares

Conteo en la cámara de Neubabuer con Azul de Tripano

• Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.
• Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.
• Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta debe quedar centrada.
• Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribución de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña o con una