Expressão da enzima ácido 1-carboxílico-1-amino ciclopropano oxidase em tomate (Lycopersicon esculen (página 2)

Foram utilizados frutos de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), cultivar Kadá, oriundos de plantas não transformadas e transformadas geneticamente com um clone de ADN, denominado pMEL1 (Balagué et alii, 1993), correspondente à ACC oxidase de melão, em orientação antisenso. Os tomateiros foram cultivados em casa de vegetação, localizada no Campus da Universidade Federal de Pelotas - Capão do Leão - RS, no período de outubro de 1994 a março de 1995.

O amadurecimento foi acompanhado em função da evolução da coloração, determinando-se o ciclo total de maturação, a produção de etileno, a síntese da enzima ACC oxidase e a composição físico-química dos frutos.

A avaliação da coloração foi realizada utilizando-se uma escala previamente estabelecida por Pratt & Workman (1962), que classifica os frutos de tomate em:

O etileno sintetizado pelos frutos de tomate foi dosado por cromatografia em fase gasosa, utilizando-se cromatógrafo a gás VARIAN 3300, de acordo com as recomendações descritas por Dupille et alii (1992). As amostras, contendo aproximadamente 1 Kg de frutos, foram acondicionadas, durante 1 hora, em frascos com capacidade de 5 litros, hermeticamente fechados após o que, coletou-se 1 ml da atmosfera gasosa para a dosagem do etileno. A produção deste regulador de crescimento foi expressa em nanolitros de etileno / hora / grama de matéria fresca (nl.h^-1.g^-1 ).

O "western blot" foi realizado a partir da metodologia descrita por Meyer et alii (1985), que compreende 4 etapas principais: 1) extração das proteínas; 2) separação eletroforética das proteínas em condições desnaturantes; 3) eletrotransferência das proteínas para membranas de nitrocelulose; 4) reações imunoquímicas de dectecção da ACC oxidase.

Para a extração de proteínas totais, 5 gramas de tomate foram homogeneizados com uma solução de ácido tricloro acético a 15% (p/v), contendo 5% (v/v) de β-mercaptoetanol. Apσs 1 hora de incubação do material a 4^oC, a mistura foi centrifugada a 20.000 g durante 30 minutos. O precipitado resultante foi lavado 5 vezes com uma solução de acetato de amônio 100 mM a 20^oC dissolvido em metanol. Finalmente, o precipitado foi dissolvido no tampão Laemmlli (Tris-HCl 25 mM, pH 6,5 contendo glicerol a 10%, p/v; β-mercaptoetanol a 5%, v/v; dodecil sulfato de sódio -SDS-a 2,3 %, p/v; e azul de bromofenol a 0,005%, p/v), de maneira a obterse aproximadamente 1µg de proteína. µl^-1.de tampão. A dosagem do teor de proteínas foi determinada segundo metodologia descrita por Harlow & Lane (1988).

A separação eletroforética das proteínas foi efetuada em condições desnaturantes, utilizando, para cada amostra, 10 µg de proteínas, em gel de poliacrilamida descontínuo.

O gel de concentração foi constituído de 4% (p/v) de N,N-metilenobisacrilamida, 0,1% (p/v) de SDS, 0,04% (v/v) de Temed, 0,03% (p/v) de persulfato de amônio dissolvidos num tampão Tris-HCl 125 mM, pH 6,8. Já o gel de separação, caracterizou-se por uma maior concentração de N,N-metilenobisacrilamida (12%) e de Tris-HCl (375 mM), pH 8,9.

A migração eletroforética das proteínas foi feita a 75V durante 30 minutos, aumentando-se a voltagem, em seguida, para 150V até o final do processo. O tampão de migração utilizado foi Tris 25 mM - glicina 192 mM (pH 8,3), contendo 0,01% (v/v) de SDS. A migração foi interrompida quando do início da saída do azul de bromofenol do gel de separação.

A eletrotransferência das proteínas para membranas de nitrocelulose 45 µm foi realizada durante 1,5 horas a 150V, num tampão Tris 25 mM -Glicina 192 mM (pH 8,3), contendo 20% (v/v) de metanol. Concluída esta etapa, as membranas foram submetidas às reações imunoquímicas, como segue: lavagem em água deionizada durante 20 minutos; incubação em tampão Tris-HCl 25 mM, pH 7,4, contendo 350 mM de NaCl, 0,01% (p/v) de NaN3 (TBS), 0,05% (v/v) de Tween 20 (TTBS) e 5% (p/v) de leite em pó desnatado, durante 1,5 horas; enxaguagem em TTBS; incubação neste mesmo tampão contendo 2% de leite em pó desnatado e os anticorpos anti-ACC oxidase (Dupille et alii, 1993) diluídos na proporção 1:10.000 (anticorpo : tampão), durante 2 horas; lavagem em TTBS; incubação com o anticorpo segundário anti-coelho, acoplado à fosfatase alcalina (Dako Laboratories), diluído 1:2.000 num tampão TTBS-2% de leite em pó desnatado, durante 1 hora e, finalmente, lavagem em TTBS e revelação utilizando o 5-bromo-4-cloro-3-indol fosfato e o nitro azul tetrazólio (BCIP/NBT-Vector Laboratories) como substratos.

Os tomates colhidos em cada estágio de maturação foram submetidos, após descascamento, às análises de pH, acidez total, sólidos solúveis, acúcares redutores, sólidos insolúveis em etanol e matéria seca, seguindo-se as recomendações descritas por Goitia et alii (l995).

O experimento foi realizado segundo um delineamento inteiramente casualizado, com cinco repetições. A comparação de médias foi efetuada através do teste de Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

A produção de etileno e o ciclo de maturação dos frutos de tomate, não transformados e transformados, estão representados na Figura 1. Houve um constante incremento na produção de etileno quando os frutos de tomate não transformados passaram do estado verde-imaturo (2 nl.h^-1.g^-1) e verde-maduro (2 nl.h^-1.g^-1) para os estágios mais avançados, "breaker" (18 nl.h^-1.g¹) e vermelhos (22 nl.h^-1.g^-1) (Figura 1A). Slater et alii (1985) demonstraram que, durante estes estágios de maturação, há a indução de mais de 300 ARNm. Dentre estes, não mais de uma dezena foram caracterizados (Kende, 1993), destacande-se os correspondentes às enzimas celulase, poligalacturonase, pectinametilesterase, ACC sintetase e ACC oxidase (Fernadez-Maculet & Yang, 1992; Grierson et alii, 986; Kende, 1993, Slater et alii, 1985). A indução da síntese destas duas últimas enzimas explicaria o aumento da produção do etileno (Kende, 1993).

Quando os frutos atingiram a fase de senescência, caracterizado pelo amolecimento generalizado dos tecidos, houve uma redução marcante na produção de etileno, atingindo valores da ordem de 7 nl.h^-1.g^-1. Este comportamento fisiológico é característico na maioria dos produtos climatéricos (Kende, 1993).

Entretanto, quando se analisa a produção de etileno dos tomates transformados, qualquer que seja o estágio de maturação, os valores são extremamente baixos, não ultrapassando 0.5 nl.h^-1.g^-1. Esta produção de etileno é similar àquela verificada em tecidos com comportamento não climatérico (frutos não climatéricos, folhas, pecíolos, embriões, etc...) e não injuriados (Abeles et alii, 1992; Adams e Yang, 1979; Kende, 1989). Estes resultados indicam que a expressão do clone de ADN pMEL 1 de melão, introduzido em orientação antisenso em plantas de tomate, é capaz de atenuar mais que 90% da produção de etileno dos frutos. O ciclo de maturação, entretanto, não foi afetado pela transformação (Figura 1B). A passagem do estágio verde-maduro para o sensescente demandou 30 dias e 27 dias para os tomates não transformados e transformados, respectivamente. Resultados similares foram obtidos por Ayub (1995), Hamilton et alii (1990) e Schuch et alii (1991).

Na Figura 2, está representado o perfil, em "western blot", da proteína ACC oxidase. Semelhantemente à produção do etileno, há um aumento marcante na quantidade desta enzima durante a maturação dos frutos de tomate não transformados. Ressalta-se, no entanto, a presença da ACC oxidase em frutos verde-imaturos (Figura 2A), que se caracterizam pela ausência de gel locular e pela incapacidade de amadurecer após a colheita. Este resultado é coerente com o fato de que todos os tecidos vegetais produzem etileno (Adams & Yang, 1979), mas discordante com os resultados obtidos por Hamilton et alii (1990) que indicam uma ausência total de ARNm correspondentes à ACC oxidase em frutos de tomate em estágios anteriores ao verde-maduro. Esta controvérsia pode ser explicada por uma diferença de sensibilidade entre as técnicas de "western blot" e de "northern blot". É possível, também, que durante o processo evolutivo haja a expressão de diferentes isoformas da ACC oxidase, detectáveis pelos anticorpos policlonais anti-ACC oxidase, mas que não tenham homologia de sequência suficientemente alta para serem postas em evidência por hibridação com a sonda utilizada nos testes moleculares (Rombaldi et alii, 1994).

Quando os tomates não transformados atingem a fase de senescência, há uma redução na produção de etileno (Figura 1A), mas o nível da proteína ACC oxidase mantém-se elevado (Figura 2A). A redução da produção deste regulador de crescimento parece não estar associada à deficiência de substrato da ACC oxidase, pois foi verificado que o aporte de ACC ao meio não restaura a atividade enzimática (Brecht, 1987). Isto indica que a ACC oxidase perde a atividade enzimática durante a degradação-senescência celular, mas preserva sua sequência aminoacídica, já que os níveis desta proteína continuam elevados e o peso molecular conservado.

Em frutos de tomate transformados, apenas pequenas quantidades de proteína ACC oxidase foram postas em evidência (Figura 2B), indicando a eficiência da técnica de transformação na inibição da expressão desta enzima. Estes resultados indicam que a atenuação da produção de etileno deste material se faz pela inibição da síntese da ACC oxidase.

Pela análise dos resultados apresentados na Tabela l pode-se verificar que, para os dois genótipos estudados, afora a acidez total, as demais características de controle de qualidade analisados, não apresentaram variações significativas. Os valores de pH obtidos, situados entre 3,76 e 3,96, são considerados adequados, tanto para o consumo in natura quanto para o processamento industrial dos tomates. Do ponto de vista tecnológico, a faixa de pH mais adequada para o processamento fica entre 3,5 e 4,3 (Goitia et alii, 1995).

Os sólidos solúveis apresentaram-se como os constituintes majoritários da matéria seca dos frutos, não havendo diferenças significativas entre os tomates transformados e não transfomados. Eles representam, em média, 4,27% do peso dos frutos e cerca de 70% dos sólidos totais ou matéria seca. Associados aos teores de sólidos insolúveis em álcool e à renda de descascamento, estes dados permitem inferir sobre os rendimentos industriais durante o processamento de tomate. Assim, após eliminada a casca, que representa, em peso, cerca de 10% dos frutos, os fatores intrínsecos ao produto que determinam o rendimento industrial e as características reológicas, são os teores de sólidos solúveis, de matéria seca e de sólidos insolúveis em álcool. Goitia et alii (1995) citam, por exemplo, que frutos apresentando uma relação SIA (sólidos insolúveis em álcool)/ MS (matéria seca) x l00 superior a 30, conferem aos frutos boas características reológicas e/ou permitem obter subprodutos pastosos de alta consistência. Os frutos aqui analisados apresentaram uma relação SIA/MS x 100 de 32.

A acidez total, apesar de ser mais elevada em frutos de tomate transformados, ainda permanece dentro dos valores médios citados na literatura (Schuch et alii,1991; Goitia et alii,1995). Esta maior acidez dos frutos transformados se deve, provavelmente, a uma menor intensidade respiratória des frutos.

Os resultados permitem concluir que o aumento da produção de etileno durante a crise climatérica de frutos de tomates se faz acompanhada da síntese da enzima ACC oxidase.

A transformação de plantas de tomate com o clone de ADN pMEL l, em orientação antisenso, permite inibir a síntese da ACC oxidase e, por consequência, a do etileno.

Uma redução da produção de etileno em 90% não é suficiente para prolongar o ciclo de maturação de tomates, quando mantidos na planta.

A composição físico-química básica não é afetada pela redução da produção de etileno.

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio Grande do Sul (FAPERGS) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento deste trabalho.

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¹ UFPEL/FAEM - Dept^o. Ciência e Tecnologia Agroindustrial - Campus Universitário - Caixa Postal, 354 - CEP 96010
900 - Tel. (0532) 75 7258 - Pelotas / RS - Brasil.
²UEPG/FA - Dept^o. Fitotecnia - Campus Universitário - Ponta Grossa / PR - Brasil.
³INPT / ENSAT - Laboratoire Éthylène et Maturation des Fruits - 147, Avenue de Muret
31300 Toulouse - França.
(Recebido para publicação em 30/11/95)