Expressão da enzima ácido 1-carboxílico-1-amino ciclopropano oxidase em tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), Cultivar kadá

RESUMO: Estudou-se a produção de etileno, a expressão da enzima ACC (ácido 1-carboxílico-1-amino ciclopropano) oxidase e as características físico-química de frutos de tomate, cultivar Kadá, não transformados e transformados geneticamente com o clone de ADN pMEL 1, em orientação antisenso. Em tomates não transformados houve um aumento da produção de etileno de 2 nl.h^-1.g^-1 para 22 nl de etileno.h^-1.g^-1

quando os frutos passaram do estágio verde-maduro para vermelho. Já, em frutos provenientes de plantas transformadas, a produção de etileno não ultrapassou os 0,5 nl.h^-1.g^-1, qualquer que fosse o estágio de maturação. A baixa produção de etileno dos frutos deste genótipo se fez acompanhada da inibição da síntese da ACC oxidase, evidenciada pela técnica de "western blot", utilizando anticorpos policlonais específicos contra esta enzima. Apesar das marcantes diferenças fisiológicas, o ciclo de maturação e a composição físico-química básica dos frutos não apresentaram variações significativas.

Palavras-Chave: Etileno, ACC oxidase, Tomate, Anticorpos

ABSTRACT: EXPRESSION OF ACC (1-CARBOXILIC-1AMINOCYCLOPROPANE) OXIDASE ENZYME ON ETHYLENE PRODUCTION IN TOMATO (Lycopersicon esculentum Mill.), KADÁ CULTIVAR. Ethylene production, ACC (1-carboxilic-1-aminocyclopropane) oxidase expression and physico-chemical characteristics were studied in tomato fruits from wild type plants of the Kadá cultivar and transgenic plants modified by pMEL 1 DNA, in antisense orientation. The production of ethylene increased of 2 nl.h^-1.g^-1 to 22 nl.h^-1.g^-1 during ripening of non transformed tomatoes. In transgenic tomato fruits, the ethylene production remained low, below 0,5 nl.h^-1.g^-1 . By western blot technic, using especific policlonal antibodies, was demonstrated that the decreasilly of ethylene was acompained by the inhibitio sintesys of ACC oxidase. However, the self life and physico-chemical composition was not altered in the transgenic tomatoes.

Key Words: Ethylene, ACC oxydase, Tomato, Antibodies

O tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) é a hortaliça mais consumida no mundo, devido à grande multiplicidade de uso e a seu aspecto, sabor e textura atraentes (Schuch et alii, 1991). No entanto, ele apresenta um processo de maturação/senescência acelerado, caracterizado por mudanças rápidas de coloração, textura, sabor e aroma. À semelhança do que ocorre com outros frutos como maçã, pêssego, pera e melão, no tomate, o processo de maturação/senescência é precedido de um incremento da síntese de etileno que, por sua vez, desencadeia um aumento na intensidade respiratória. Este fenômeno, chamado crise climatérica, é acompanhado de mudanças importantes a nível de expressão de genes que parecem ser a origem do processo de maturação (Slater et alii, 1985).

Vários clones de ADN, correspondentes a ARNm que se acumulam em abundância durante a maturação do tomate, foram isolados mas, inicialmente, somente os genes correspondentes à poligalacturonase (Grierson et alii, 1986) e à ACC (ácido 1-carboxílico-1amino ciclopropano) sintetase (Wang & Woodson, 1991) foram identificados. Estas descobertas, além de fornecerem dados importantes para a melhor compreensão dos fenômenos de expressão e regulação daqueles genes, constituem-se em fato de grande importância econômica, já que atualmente estão sendo cultivados, em escala comercial, tomates transgênicos com baixa atividade da poligalacturonase (Pech et alii, 1994). Também, a nível laboratorial, dispõem-se de plantas de tomate transformadas com um clone de ADN correspondente à ACC sintetase, em orientação antisenso (Pech et alii, 1993). É o regulador de crescimento etileno que está implicado na regulação destas mudanças metabólicas, por intermédio de uma cadeia de transdução de sinais. Vários trabalhos recentes enfocam este tema, porém os mecanismos ainda não são conhecidos (Adams & Yang, 1979; Abeles et alii, 1992; Kende, 1989, l993; Pech et alii., 1994; Theologis, 1993; Yang & Hoffman, 1984).

Entretanto, se os avanços científicos permitiram que outras enzimas da via de biossíntese do etileno ou implicadas na processo de maturação de frutos já estejam bem caracterizadas e os genes respectivos isolados e clonados, pouco foi obtido em relação à ACC oxidase. Somente em 1991, Ververides & John conseguiram, pela primeira vez, extrair e dosar a atividade desta enzima in vitro. A partir de então, ela foi purificada em vários frutos; teve sua sequência parcialmente determinada; anticorpos policlonais foram obtidos e clones de ADN foram isolados (Balagué et alii, 1993; Dupille et alii, 1993; Hamilton et alii, 1991; McGarvey & Christoffersen, 1992; Pirung et alii, 1994).

Com a caracterização feita por Balagué et alii (1993) de um clone de ADN, denominado de pMEL l, correspondente à ACC oxidase de melão, iniciaram-se trabalhos de transformação genética, via Agrobacterium tumefaciens, em tomate e melão. Em ambos os casos, este clone foi inserido, em orientação antisenso, num vetor binário (plasmídeo pGA 643). Resultados preliminares, altamente promissores, foram descritos por Ayub (1995) que obteve melões transgênicos com baixa produção de etileno e maior conservabilidade.

Dentro deste contexto, o presente trabalho visa estudar a evolução da maturação de frutos de tomate não transformados e transformados geneticamente com o clone pMEL 1 de melão em orientação antisenso.