Inibidores da proteína NOTCH1 para o tratamento de leucemias (página 2)

Figura 1: Esquema figurativo da diferenciação das células hematopoiéticas normais. Uma célula estaminal inicial se diferencia dando origem a um precursor mielóide e um precursor linfóide, e a partir destes precursores a diferenciação em diferentes linhagens, como por exemplo o precursor linfóide que originará os linfócitos T e B. Retirado de: Mansur, M. B. Mutações do gene Notch1 e outras alterações moleculares relacionadas à etiopatogénese das leucemias linfoblásticas agudas de linhagem T (LAA-T).

1.1.1 ) MATURAÇAO DOS LINFÓCITOS

A medula óssea e o timo são designados órgãos linfóides primários, uma vez que proporcionam microambientes essenciais para a linfopoiese, isto é a produção de linfócitos a partir de um progenitor não-diferenciado. Os linfócitos B maturam na medula enquanto que os linfócitos T maturam no timo, e esses em seguida se direccionam para os órgãos linfóides secundários (gânglios linfáticos, baço e os tecidos linfóides associados as mucosas e à pele), onde ocorrem às respostas imunes aos antígenos (1, 2).

Os linfócitos T que emigram do timo e colonizam os órgãos linfóides secundários são chamados de células virgens (naive), pois ainda não foram activadas por contato com antígeno. Após o contacto com antígenos, os linfócitos T participam da resposta imunológica como linfócitos T auxiliares (CD4+) ou T citotóxicos (CD8+) (1, 2).

As leucemias são um grupo de doenças com diferentes fisiopatologias, manifestações clínicas e prognósticas. O traço comum entre elas é o acúmulo ou proliferação desregulada de um dos tipos de leucócitos na medula óssea, sangue e no tecido linfóide. Nas leucemias ocorrem mutações genéticas nas células mielogénicas ou linfogénicas, que passam a se multiplicar de forma desordenada.

As leucemias podem ser classificadas em dois tipos gerais: as leucemias linfocíticas e as leucemias mielóides, de acordo com o tipo celular acometido. As leucemias mielóides são produzidas à partir da reprodução desordenada das células mielóides imaturas da medula óssea, que se disseminam por todo o corpo de modo que a multiplicação das células mielóides pode ocorrer em órgãos extramedulares, como os gânglios linfáticos, o fígado e o baço. As leucemias linfocíticas são causadas pela produção desordenada de células linfóides, que surgem nos gânglios linfáticos ou noutros tecidos linfóides e disseminam-se para outras áreas do organismo (3).

A evolução das leucemias pode ser aguda ou crónica. Quando o processo de crescimento desordenado ocorre de forma muito rápida, com o aparecimento de um grande número de células imaturas, estaremos diante de uma leucemia aguda, ao contrário, se a multiplicação celular é mais lenta e produz células mais evoluídas na sua sequência de maturação, a leucemia será do tipo crónico.

De forma simples, as leucemias agudas caracterizam-se por um grave defeito de maturação, induzindo a um acúmulo de células imaturas e a uma falha na produção de células hematopoéticas diferenciadas. Sendo assim, estas células imaturas não são capazes de desempenhar suas funções normais (1).

1.2.1) LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA DE LINHAGEM T (LLA-T)

A leucemia linfoblástica aguda de linhagem T (LLA-T) é uma neoplasia hematológica altamente agressiva, caracterizada por infiltração da medula óssea com linfoblastos imaturos, constitui prevalência de 15% em crianças e 25% em adultos (4). Pacientes com LLA-T, geralmente apresentam no diagnóstico tumores com elevado número de células leucémicas circulando no sangue periférico, massas mediastinais e infiltração frequente do sistema nervoso central no momento do diagnóstico (5).

Inicialmente associado com mau prognóstico, actualmente a LLA-T pode ser curada em cerca de 80% dos casos em crianças e 50% dos casos em adultos, graças à utilização de protocolos quimioterápicos de alta intensidade (4). As mutações activadoras do gene NOTCH1 estão presentes em mais de 50% dos casos de LLA-T, fazendo de NOTCH1 o oncogene mais proeminente, especificamente envolvido na patogénese desta doença.

A LLA-T continua sendo um problema clínico, sendo o prognóstico para os pacientes que apresentam resistência a doença ou recaída após remissão completa, ainda muito desfavorável, destacando assim a necessidade do desenvolvimento de drogas antileucémicas mais específicas e altamente eficazes. Embora os mecanismos biológicos e moleculares específicos que contam para a agressividade e ineficiente resposta terapêutica da LLA-T permanecem a ser elucidados, estudos citogenéticos, moleculares e genómicos têm mostrado a ligação na activação anormal da via de sinalização de NOTCH1, fazendo desta uma alternativa interessante para o estudo de novas técnicas no tratamento da LLA-T (5,6).

Em eucariotas, a geração de diferentes tipos de células depende de mecanismos que estabelecem e mantêm programas específicos de expressão de genes. Central, neste processo, é a função desempenhada por factores de transcrição, que actuam em conjunto para activar ou reprimir grupos específicos de genes-alvo em ambiente celular apropriado. Estes, são particularmente relevantes no sistema hematopoiético, em que a diferenciação e leucemogénese são controlados pelas interacções combinadas de factores de transcrição de diversas famílias (7).

A LLA-T tipicamente é caracterizada pela presença de mutações envolvendo os genes que codificam os receptores de células T (TCR) e em vários genes de factores de transcrição incluindo: HOX11, LMO1, TAL1, HOX11L2, LMO2, dentre outros. Sendo NOTCH1 o mais frequente em LLA-T, e é neste em que iremos focar esta revisão bibliográfica.

1.3.1) O GENE NOTCH

O gene NOTCH1 humano foi descrito pela primeira vez por Ellisen e cols em 1991. Este estudo além de identificar pela primeira vez o gene NOTCH1 em humanos, também descreveu seu importante papel em neoplasias humanas, identificando uma translocação cromossómica envolvendo o gene NOTCH1 em um paciente com LLA-T (8).

A família NOTCH é subdividida em: NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3 e NOTCH4, e que todos desempenham função na embriogénese. Cada representante da família NOTCH, codificam uma proteína (NOTCH1-4) que actua como receptor transmembranar, com diferente função para cada um deles. Os receptores NOTCH são expressos em vários tipos de células e estão envolvidos na diferenciação, escolha e especificação de destino e proliferação celular. A activação dos receptores NOTCH é normalmente induzida pela ligação de ligandos expressos em células vizinhas, são eles: Delta-like-1, Delta-like-3, Delta-like-4, Jagged-1 e Jagged-2 (1,9,10).

1.3.2) O RECEPTOR NOTCH1

O receptor NOTCH é uma proteína transmembranar de única passagem consistindo de um único peptídeo, tem uma componente extracelular que é responsável pela interacção com os ligandos, um domínio transmembranar responsável pela activação do receptor, e um domínio de sinalização intracelular. Os ligandos de NOTCH interagem com o receptor de células adjacentes por um processo designado inibição lateral. Essa ligação entre receptor NOTCH e o ligando, leva a activação da via NOTCH nesta célula e a supressão da actividade nas células adjacentes (9).

Os receptores NOTCH desempenham um papel crítico na especificação do destino celular durante o desenvolvimento embrionário e participa em vários processos biológicos. Na activação do sistema hematopoiético NOTCH1 desempenha um papel crítico em múltiplas fases do desenvolvimento de linfócitos T. A perda da função de NOTCH1 em progenitores hematopoiéticos resulta em bloqueio completo nos primeiros estágios da linfopoiese de células T. Sabe-se que NOTCH1, no desenvolvimento de célula T tem como funções: regulação da manutenção de célula estaminal hematopoiéticas, diferenciação e auto-renovação celular, decisão celular quanto à linhagem (definindo se um linfócito será T ou B), comprometimento de células estaminais para o desenvolvimento de células T funcionais e, particularmente, para a formação de receptores de antígeno em timócitos imaturos (1,6).

1.3.2.1) ESTRUTURA DOS RECEPTORES NOTCH

Os receptores NOTCH são glicoproteínas transmembranares de classe I expressas na superfície da célula, composto de duas subunidades: um fragmento N-terminal extracelular (NEC) e uma subunidade C-terminal transmembranar intracelular (NTM). A porção NEC do receptor é constituído por uma série de domínios tipo factor de crescimento epidérmico (EGF-Like) que medeiam a interacção com os ligandos, seguido por três repetições LIN-12/NOTCH (LNR) que, na ausência de ligando, mantém o receptor numa conformação resistente a proteases. Durante o tráfego da proteína para a superfície da célula, o LNR é cortado por uma protease furina em um local chamado S1, dividindo NOTCH em duas subunidade que são mantidas juntas por contactos nas porções N-terminal e C-terminal de LNR. As subunidades NEC e NTM permanecem associadas no receptor em repouso através do domínio de heterodimerização (HD). Os domínios HD e LNR são associados intimamente e juntos formam um bloqueio molecular que desempenha um papel crítico na prevenção de activação espontânea do receptor, na ausência de interacção ligando-receptor. A porção intracelular de NOTCH (ICN) contém o domínio RAM, seguido por uma série de repetições tipo anquirina (ANK), o domínio de transactivação (TAD), e o domínio PEST [prolina (P), ácido glutâmico (E), serina (S) e treonina (T)], que limita a intensidade e duração da activação de NOTCH [Figura 2] (9,10,11).

Figura 2: Desenho esquemático da estrutura do receptor NOTCH1, mostrando as subunidades extracelular (EC) e transmembranar (TM). A subunidade EC é composta pelas porções EGF-Like, LNR e parte do HD, e a subunidade TM esta caracterizada por parte de HD, e porções RAM, ANK, TAD e PEST. Retirado de: Mansur, M. B. Mutações do gene Notch1 e outras alterações moleculares relacionadas à etiopatogénese das leucemias linfoblásticas agudas de linhagem T (LLA-T).

1.3.2.2) MECANISMO DE ACTIVAÇAO DO RECEPTOR NOTCH1

Após a interacção com seus ligandos, NOTCH1 sofre uma alteração conformacional nas repetições LNR, que desestabiliza a interacção entre as duas subunidades do domínio HD. Como resultado, o segmento C-terminal da subunidade HD é exposta como substrato para a proteína ADAM10, uma metaloprotease expressa na superfície da célula, que cliva a porção extracelular do receptor, no local chamado S2. Após a clivagem S2, NOTCH1 sofre uma segunda clivagem proteolítica na região transmembranar do receptor, chamado S3, catalizado pela enzima gama-secretase, essa liberta o domínio intracelular do receptor (ICN) no citoplasma. Com o ICN livre, este em seguida se transloca para o núcleo, onde interage com o factor de transcrição do DNA, CSL. O envolvimento de ICN com CSL cria um sulco longo, e raso na interface entre as duas proteínas que serve como uma superfície de ligação para as proteínas coactivadoras da família Mastemind-Like (MAML). O complexo ternário resultante ICN-CSL-MAML então recruta os factores necessários para a transcrição, efectuando a activação dos genes alvos de NOTCH1 (Figura 3). O efeito de ICN é limitado pela ubiquitinação e degradação, este processo é regulado pela ligase E3 ubiquitina (gene FBXW7) que se liga ao domínio PEST no C-terminal de ICN. No cancro mutações no NOTCH1, activam sua via independente de interacção com ligando e, com isso, o ICN é constantemente libertado e translocado para o núcleo, o que activa desordenadamente a transcrição génica (5,11,12,14,15).

Figura 3: A figura mostra a via de sinalização de NOTCH1. Quando o receptor NOTCH1 é activado, pela interacção de ligandos como Delta-Like e Jagged, ocorre uma mudança conformacional em LNR e dissociação das duas subunidades do domínio HD, seguindo a clivagem do receptor, primeiro pela metaloprotease ADAM10 (clivagem S2) e subsequentemente pelo complexo de gama-secretase (clivagem S3). Esses processos proteolíticos libertam o domínio intracelular (ICN1) de NOTCH1 da membrana. ICN1 interage com o DNA através da sua ligação com CSL e recruta o coactivador MAML1 para activar a expressão de genes alvos. Retirado de: Palomero, T.; Fernando, A. Therapeutic targeting of NOTCH1 signaling in T-ALL. Clin Lymphoma Myeloma. 2009; 9 (Suppl 3): S205.

A duração e intensidade da sinalização de NOTCH é normalmente bem controlada, dado que mutações onde há perda de função têm sido observadas em várias doenças, mutações onde há ganho de função na via NOTCH são particularmente relacionadas ao cancro. O NOTCH1 humano foi descoberto pela primeira vez devido ao seu envolvimento em uma translocação cromossómica t(7;9), observada em pacientes com LLA-T (Ellisen et al, 1991) e posteriormente, várias mutações activadoras de NOTCH1 foram descobertas em mais de 50% dos pacientes com LLA-T (Weng. et al, 2004). Além da sua relação com LLA-T, as mutações em NOTCH também têm sido observadas em cancros do pulmão, ovários, pâncreas e do tracto gastrointestinal, bem como em pacientes com melanoma, mieloma múltiplo e meduloblastoma (8,12,13).

Mutações activadoras de NOTCH1 normalmente interrompem os bloqueios moleculares responsáveis pela prevenção da activação espontânea do receptor na membrana ou mediando o término da sinalização de NOTCH1 no núcleo. Logo, uma das mutações ocorre no domínio HD e estão presentes em cerca de 40% dos casos de LLA-T humanos, essas promovem instabilidade no receptor NOTCH1, resultando em activação independente de ligando, aumentando a libertação do ICN e sua consequente deslocação para o núcleo. Outro tipo de mutação ocorre na extremidade 3" do gene, onde está codificado o domínio PEST, essas estão presentes em 15% dos pacientes e são responsáveis pela eliminação da sequência de reconhecimento para a degradação de ICN pelo complexo FBXW7/SCF no núcleo, assim há um aumento da meia-vida nuclear de ICN e consequentemente acentuação da actividade de NOTCH1. Em casos raros, NOTCH1 é activado como resultado de inserções in-frame na parte distal do domínio HD, resultando no deslocamento e consecutivo processamento no local de clivagem da protease ADAM10 (1,11).

Além dessas mutações no gene NOTCH1, cerca de 15% dos pacientes com LLA-T apresentam mutações no gene FBXW7, que tipicamente envolvem resíduos de arginina, responsáveis pelo reconhecimento dos locais de fosforilação do domínio PEST do receptor NOTCH1. Estas mutações dificultam o reconhecimento do complexo FBXW7/SCF, prejudicando a degradação de ICN no núcleo. Finalmente, cerca de 20% dos pacientes apresentam mutações duplas no domínio HD e PEST ou em HD e FBXW7. A presença de mutações nos domínios HD e PEST/ FBXW7 induz a activação na membrana, independente de ligando, e prejudica a degradação do receptor activado no núcleo, resultando em altos níveis da sinalização de NOTCH1 (6,11,15).

Logo, existe uma relação clara entre mutações no gene NOTCH1 e LLA-T, com fortes evidências de que essa indução de LLA-T por NOTCH1 requer uma contínua sinalização desta via para o crescimento e sobrevivência celular, sendo assim uma descoberta extremamente interessante quando falamos em novas técnicas para o tratamento da LLA-T.

A activação da via de sinalização de NOTCH é claramente estabelecida em LLA-T e é provável que esteja envolvida na génese de muitos outros tipos de tumores. Assim, não é surpreendente que os esforços para bloquear a sinalização de NOTCH como estratégia terapêutica, estejam em pesquisa tanto para LLA-T como para outros tipos de cancro. Uma das abordagens mais promissoras tem sido a inibição da sinalização do receptor NOTCH usando um inibidor de gama-secretase (GSI).

1.5.1) INIBIDORES GAMA-SECRETASE (GSIs)

A importância das mutações NOTCH1 em LLA-T é realçada pelo seu potencial papel em NOTCH1 como um alvo molecular terapêutico para o tratamento desta doença. Dado que é necessário a clivagem, pela gama-secretase, para activação de NOTCH1, a efectiva inibição farmacológica deste complexo proteolítico anula a sinalização oncogénica na LLA-T (figura 4). O complexo gama-secretase pode ser bloqueado com um pequena molécula inibidora de gama-secretase (GSIs), tendo sido essa foco de extensa pesquisa por várias empresas farmacêuticas por causa de seu papel na patogénese da doença de Alzheimer. Esses GSIs funcionam como pan-NOTCH, ou seja, inibem a actividade dos quatro tipos de receptores NOTCH. Os primeiros estudos sobre a actividade dos GSIs como uma terapia anti-NOTCH para LLA-T, resultaram em rápida eliminação da proteína NOTCH1 activada e eficaz regulação negativa dos genes alvos de NOTCH1, nas linhas celulares estudadas. Mais notavelmente, a inibição de NOTCH reduziu o crescimento e proliferação através da indução na parada do ciclo celular (G1) e diminuindo o tamanho da célula. Esses resultados foram seguidos por ensaios clínicos feitos em uma pequena amostra de pacientes, porém a técnica apresentou problemas tanto em não atingir os objectivos iniciais de inibir a activação de NOTCH como o aparecimento de efeitos secundários relacionados com a droga (6,11).

Os primeiros resultados apresentaram que os GSIs pareceram ter mínima ou nenhuma actividade apoptótica contra as células de LLA-T, porém deve ser notado que a maior parte das linhas celulares de LLA-T, portadoras de mutações NOTCH1 não requerem contínua sinalização de NOTCH1 para proliferação e sobrevivência in vitro, assim apresentando resistência a GSIs. E também foi observado toxicidade gastrointestinal nos pacientes tratados com GSIs, isso ocorre porque há bloqueio de todos os receptores NOTCH, em particular NOTCH1 e NOTCH2 que desempenham um papel importante no epitélio gastrointestinal, resultando em metaplasia das células caliciformes devido à diferenciação distorcida das células epiteliais. Assim células que deveriam actuar como enterócitos acabam actuando como células secretoras (6,11,16).

Esses resultados sugerem que estratégias alternativas, com uma melhor janela terapêutica são necessários para a implementação bem-sucedida de GSIs como terapia anti-NOTCH em LLA-T. A este respeito, relatórios recentes da Merck demonstraram que a inibição de 70% de NOTCH em somente três dias com GSI é suficiente para induzir respostas antileucémicas eficazes em modelos xenográficos de LLA-T. Uma abordagem semelhante, com dosagem intermitente mostrou reduzir a toxicidade associada com PF-0308414, um GSI desenvolvido pela Pfizer. Estes resultados mostram que a metaplasia induzida pelos GSIs é dependente de tempo e dose e pode ser evitada usando esquemas de dosagem intermitentes. Uma abordagem alternativa para melhorar a segurança e eficácia de terapias anti-NOTCH em LLA-T pode resultar da combinação de GSIs com quimioterápicos ou outras drogas. A idéia é a utilização de GSIs em doses elevadas por curtos períodos de tempo para evitar o desenvolvimento de toxicidade gastrointestinal, enquanto o uso de combinação com outras drogas aumentaria sua eficácia (11).

Uma alternativa interessante que está sendo bastante estudada actualmente é a combinação de GSI com glucocorticóides. Os glucocorticóides são drogas essências no tratamento de LLA-T, devido à sua capacidade para induzir a apoptose e parar o ciclo celular em linfoblastos de leucemias (Real P. J , Ferrando A. A., 2009). A importância dos glucocorticóides no tratamento de LLA-T é realçado pelo mau prognóstico associado a uma resposta inicial limitada e a um desenvolvimento frequente de resistência a glucocorticóides em doentes de recaída, identificando este como um contribuinte na falha do tratamento. Assim quando em combinação com GSI, estudos mostraram que linhas celulares tratadas por duas semanas apresentaram aumento na resposta ao tratamento de glucocorticóides (apoptose) e inibição da sinalização de NOTCH em linhas celulares de LLA-T, que a princípio apresentavam resistência aos mesmos. Estudos mostram que os GSIs podem reverter a resistência de glucocorticóide em LLA-T e além disso, o tratamento com glucocorticóides antagoniza a toxicidade intestinal associada com a inibição sistémica de NOTCH, causada pelos GSIs, reforçando a idéia de um tratamento combinado destas duas drogas (4,6,17).

Em geral, estes resultados sugerem fortemente que as terapias de combinação de GSIs com glucocorticóides podem potenciar os efeitos antileucémicos de GSIs e podem ser eficazes contra a resistência de glucocorticóide em LLA-T, identifica os glucocorticóides como reguladores críticos na determinação do destino celular e homeostase do tecido no intestino e sugere que o tratamento com glucocorticóides pode facilitar o desenvolvimento clínico de GSIs, protegendo o intestino contra toxicidade, tipicamente associado com a inibição sistémica da sinalização de NOTCH.

Figura 4: Diferentes abordagens para inibição do receptor NOTCH1. A inibição a partir de GSIs, bloqueando a actividade de gama-secretase, que é necessária para a clivagem do domínio intracelular de NOTCH. A utilização de anticorpos que ligam no ligando Delta-Like-4, prevenindo a ligação e a activação de NOTCH a partir de ligandos. A inibição por anticorpos específicos ao receptor NOTCH1, impedindo a clivagem proteolítica da região reguladora negativa, mesmo após activação pelo ligando. Retirado de: Ryeom, S. W. The cautionary tale of side effects of chronic Notch1 inhibition. The Journal of Clinical Investigation. 2011; 121: 508-509.

1.5.2) INIBIÇAO DE NOTCH POR ANTICORPOS ESPECÍFICOS

Como discutido, embora os GSIs tenham potencial e seguiram na pesquisa clínica, como não conseguem distinguir entre os receptores NOTCH, acabam por inibir outras vias de sinalização causando efeitos secundários como a toxicidade no intestino (atribuída a inibição de NOTCH1 e NOTCH2). Com o objectivo de elucidar as funções de NOTCH1 e NOTCH2 e desenvolver inibidores que reduzam a toxicidade intestinal, Yan e cols (18) desenvolveram anticorpos específicos aos receptores NOTCH1 e NOTCH2. Utilizando a tecnologia de apresentação de fagos para a geração de anticorpos altamente especializados que antagonizam especificamente cada receptor, e servem tanto para humanos como para ratinhos, permitindo assim a discriminação dos receptores NOTCH1 e NOTCH2. Estes anticorpos específicos de NOTCH1 e NOTCH2 estabilizam a região reguladora negativa de NOTCH1 e NOTCH2, localizada na parte extracelular justamembranar, evitando a clivagem do domínio intracelular, mesmo na presença de ligandos [figura 4] (18,19).

Esses anticorpos mostraram inibição, dependente de dose, na sinalização in vitro de ambos NOTCH1 e NOTCH2 e alta especificidade ao seu respectivo receptor. No entanto, não é surpreendente que o tratamento com anticorpo específico de NOTCH1 tenha mostrado uma diminuição significativa no número de linfócitos CD4+ e CD8+, devido ao seu papel no desenvolvimento dessas células. Os resultados do teste deste anticorpo específico de NOTCH1 em linhas celulares de LLA-T (que contêm mutações em NOTCH1) foram a inibição do crescimento celular em in vitro e em modelos xenotransplantados in vivo. Foi testado também em tumores xenotransplantados que não continham mutações em NOTCH1, e os resultados mostraram supressão de tumor, e isso é explicado pela inibição da angiogénese do tumor, outra descoberta interessante ao nível da utilização desta técnica noutros tipos de cancro (18,19).

Relacionado ao problema de toxicidade intestinal, cuja técnica pretendia resolver, ao serem feitas pesquisas utilizando ambos anticorpos e somente o anticorpo específico a NOTCH1, foi descoberto que a inibição isolada de NOTCH1 é suficiente para induzir alguma metaplasia de células caliciformes, no entanto, este efeito foi relativamente menor quando comparado com a inibição de ambos receptores NOTCH1 e NOTCH2. No entanto, no trabalho de Yan e cols (18), a inibição mediada por anticorpos específicos a NOTCH1 somente foram examinados por um período de tempo relativamente curto (2-3 semanas), e as consequências da inibição de NOTCH1 a longo prazo não foram ainda investigadas (18,19).

Assim ao reduzir ou evitar a metaplasia de células caliciformes gastrointestinais, uma característica do bloqueio sistémico dos receptores NOTCH, os anticorpos inibidores específicos aos receptores NOTCH representam um avanço quando comparados aos inibidores sistémicos GSIs.

1.5.3) ANTICORPOS ESPECÍFICOS DO LIGANDO DELTA-LIKE-4

Pesquisas mostram que anticorpos específicos ao ligando Delta-Like-4, que funcionam prevenindo a ligação de ligandos e subsequente activação de NOTCH (figura 4), não tem impacto na diferenciação das células caliciformes e/ou a proliferação das células progenitoras das criptas. Logo tornando esses alvo de interesse como um inibidor de NOTCH que não apresentem efeitos secundários relacionados com a toxicidade gastrointestinal e pela sua directa relação no funcionamento da angiogénese, assim esta técnica vem sendo muito estudada para a utilização no combate ao crescimento de tumores sólidos.

O ligando Delta-Like-4 (Dll4) é um componente importante na via NOTCH que contribui para a auto-renovação das células estaminais e para o desenvolvimento vascular. A deleção de um único alelo de Dll4, resulta em letalidade embrionária devido a efeitos de desenvolvimento na vasculatura. Sendo assim, o ligando Dll4 é altamente expresso na vasculatura e parece desempenhar um papel importante na angiogénese tumoral, sugerindo ser um alvo promissor. A inibição de Dll4 conduz a um aumento da vascularização do tumor, com melhor germinação angiogênica e ramificação. Paradoxalmente, este aumento da vascularização é improdutivo e leva a perfusão, aumento da hipóxia e diminuição do crescimento tumoral (9,20).

Muitos estudos com alvo no ligando Dll4/NOTCH têm confirmado o impacto no crescimento e angiogénese tumoral, mostrando uma ampla actividade anti-tumoral em uma grande variedade de tumores. Embora a maioria das abordagens anti-angiogênicas, actuais, actuem através da redução ou eliminação dos vasos tumorais, o bloqueio de Dll4 resulta na formação de uma vasculatura não funcional, incapaz de suportar o crescimento tumoral. Duas grandes alterações seguidas da inibição de Dll4/NOTCH seriam as responsáveis por essa função defeituosa na vasculatura tumoral: o comprometimento da formação do lúmen (sendo incompatível com a passagem de células sanguíneas) e a formação caótica da rede vascular (causando uma microcirculação disfuncional e hipóxia local). Tumores alvos deste tipo de inibição apresentam hiperproliferação de células endoteliais, juntamente com uma redução na proteção do endotélio tumoral, o que pode tornar o tumor mais susceptível a agentes que têm como alvo células proliferativas. Assim, a utilização de anti-Dll4 em combinação com quimioterapia mostra uma melhor actividade anti-tumoral em modelos pré-clínicos, apesar da preocupação de que a perfusão reduzida dos vasos tumorais possa interferir na entrega desses agentes terapêuticos (16).

Embora a inibição seletiva do ligando Dll4, aparentemente evite a toxicidade gastrointestinal, outros problemas relacionados com a segurança foram levantados. Estudos realizados por Yan e cols (18), mostram substanciais alterações patológicas no fígado após 8 semanas do tratamento com o anticorpo específico para Dll4 em animais de várias espécies, de ratos a macacos. Genes endoteliais específicos, conhecidos por serem importantes para diferentes aspectos da activação endotelial aumentaram sua proliferação no fígado após o bloqueio do ligando Dll4, implicando assim um papel de Dll4/NOTCH1 na manutenção da sinalização do endotélio do fígado num estado quiescente. Além disso, um subconjunto de ratos tratados durante 8 semanas com o anticorpo específico ao ligando Dll4, desenvolveram neoplasias vasculares subcutâneas de uma maneira dependente de dose, o que sugere que a inibição da sinalização de NOTCH1 possa perturbar a homeostase celular normal do endotélio vascular levando a tumores. No entanto, as potenciais consequências da exposição por um maior período de tempo em outras espécies permanecem incertas (16,19).

Uma outra alternativa da utilização desta terapia surgiu a partir de estudos pré-clínicos que sugeriram que o bloqueio de Dll4/NOTCH1 poderia aumentar a eficácia de anti-VEGF em tumores sensíveis, podendo assim ter um potencial para aumentar os efeitos de quimioterapias ou outras terapias dirigidas em tumores que são intrinsecamente menos dependentes de VEGF ou que tenham progredido devido a uma mudança na dependência noutras vias angiogênicas (16).

É interessante pensar que a combinação de drogas, como a combinação de GSIs com glucocorticóides, possa servir de base para outras terapias, como neste caso, sabendo que o efeito do bloqueio do ligando Dll4/NOTCH1 possa ser parcialmente atribuído ao aumento da sinalização de VEGF, a utilização de um anti-VEGF talvez possa proteger contra toxicidade mediada por anti-Dll4.

Finalmente, é importante salientar que, dado o potente efeito no bloqueio de Dll4/NOTCH1 e das suas implicações potenciais na segurança do tratamento, o desenvolvimento de terapias utilizando anticorpo de anti-Dll4/NOTCH1 exige cuidado e monitoramento dos pacientes, até que seus efeitos tóxicos sejam melhor compreendidos.

1.5.4) INIBIÇAO ATRAVÉS DO PÉPTIDO SAHM1

Os factores de transcrição são muito importantes na regulação da célula. Comumente activados por eventos genéticos ou através das vias de sinalização, eles medeiam o fenótipo neoplásico e mantém a especificação tecidual em cancros. Assim, esses são alvos altamente desejáveis para estudo de moléculas que possam inibir esse processo.

No processo de activação de NOTCH1, após a libertação do domínio intracelular (ICN) este vai para o núcleo e liga-se ao factor de transcrição CSL, recrutando o coactivador chamado MAML1 para então ocorrer a transcrição dos genes alvo de NOTCH1. Moellering e cols (14) recentemente desenvolveram SAHM1, um péptido que se liga ao complexo ICN-CSL, directamente antagonizando o recrutamento de MAML1, logo bloqueando a transcrição dos genes alvos de NOTCH1, mesmo estando este ativado (Figura 5).

Figura 5: Mecanismo de inibição de SAHM1. A parte a da figura ilustra o processo de activação de NOTCH1 no núcleo, mostrando a ligação do factor de transcrição CSL e coactivador MAML1 ao ICN para activação dos genes alvos. E na parte b da figura temos a inibição deste processo pelo péptido SAHM1, que impede que a MAML1 se ligue ao complexo ICN-CSL, bloqueando a activação dos genes alvos. Retirado de: Arora, P. S.; Ansari, A. Z. A Notch above other inhibitors. Nature. 2009; 462: 171-173.

Moellering e cols (14) demonstraram um péptido alfa-helicoidal estável, permeável à célula que tem como alvo a interface proteína-proteína responsável pelo recrutamento de MAML1 no complexo de transactivação NOTCH-CSL (Figura 5). Este consegue bloquear eficazmente a sinalização de NOTCH1, como demonstrado em linhas celulares de ratinhos e humanos, comprovando seu efeito antileucémico (14). Análise directa dos níveis dos genes alvos de NOTCH e do perfil de expressão global, quando induzido por SAHM1 confirmou o bloqueio da sinalização de NOTCH em linhas celulares de LLA-T. Dada a complexidade das respostas transcricionais, é impossível afirmar que não houve nenhum bloqueio fora do alvo NOTCH quando tratado com SAHM1 (14).

Portanto, o tratamento com SAHM1 provou a repressão da progressão leucémica e inibiu a sinalização do receptor NOTCH1 em modelos animais de LLA-T. Nesses estudos, não foram observados nenhum tipo de toxicidade gastrointestinal no momento da necropsia dos animais tratados, embora a avaliação a longo prazo da actividade de SAHM1 como um agente terapêutico é necessária, os resultados iniciais indicam um potencial terapêutico.

• PROGNÓSTICO

Já foi muito bem definido a participação do receptor NOTCH1 no desenvolvimento dos linfócitos T e seu envolvimento na formação vascular durante o desenvolvimento embrionário. Sabemos também que dependendo do órgão e do tipo de tecido, a sinalização de NOTCH pode inibir ou induzir a proliferação, diferenciação e sobrevivência celular, este efeito de NOTCH no destino de linhagem celular é baseado na expressão de certos genes de forma bem específica (9). Assim é difícil falar em prognóstico para uma doença onde há o envolvimento de diversos tipos de mutações que podem influenciar no tratamento, logo ao tentar-se entender melhor cada mutação, talvez possamos traçar quais as técnicas com melhores resultados para cada uma delas.

Desde a descoberta da alta frequência de mutações no gene NOTCH1 em pacientes com LLA-T, várias técnicas foram desenvolvidas tendo como alvo o bloqueio de NOTCH1 como uma forma de tentar aumentar o prognóstico dos pacientes, principalmente como um tratamento alternativo para os pacientes com recaída, que normalmente criam resistência quimioterápica.

Uma das terapias mais promissoras foi o desenvolvimento de GSIs, que mesmo com seus efeitos tóxicos e os questionamentos quanto a efectividade, foram um avanço para as terapias alternativas. Muitos dos problemas apresentados vêm sendo amenizados com terapias combinadas, e uma melhor compreensão na influência das diferentes mutações, podem ajudar a esclarecer a resistência a esta terapia. Uma das mutações que é muito frequente em tumores sólidos de vários cancros e em LLA-T se encontra no gene PTEN, este produz uma proteína de mesmo nome, e age como um gene supressor de tumor. Ele está envolvido na regulação do ciclo celular, prevenindo que as células cresçam e se dividam muita rapidamente. Essas mutações no gene PTEN e a perda da expressão de sua proteína são altamente frequentes em linhas celulares de LLA-T, e podem ser encontrados como um evento secundário na progressão da doença. Sabe-se que essas mutações, diminuem a resposta ao tratamento dos GSIs (21,22). Assim pacientes que apresentarem esse tipo de mutação, talvez mostrem melhor prognóstico quando tratados com outro tipo de terapia.

A importância prognóstica das mutações em NOTCH1 em LLA-T ainda permanece controversa. Alguns estudos mostram como um factor de prognóstico favorável e outros não conseguem encontram a relação entre ambos. Por exemplo, um recente estudo com uma amostra de 157 crianças com LLA-T tratados com o protocolo de ALL-Berlin-Frankfurt-Munster (82 com mutações no gene NOTCH1), estabeleceu a associação entre mutações em NOTCH1 com um excelente prognóstico (23,24).

Em até 30% das crianças com LLA-T, mutações em ambos genes NOTCH1 e FBXW7 também foram associados como um favorável prognóstico. Mais recentemente, as mesmas afirmações foram feitas para adultos com LLA-T, porém esses foram associados com casos de recaída (23). A hipótese que pode explicar as diferenças no valor prognóstico das mutações de NOTCH1 e FBXW7 em diferentes estudos, reflete da questão de que as amostras dos pacientes com LLA-T foram tratadas com diferentes protocolos quimioterápicos e que a sinalização anormal de NOTCH1 possa afetar a sensibilidade das várias drogas quimioterápicas em intensidades diferentes.

Assim, baseado nos diferentes estudos com resultados controversos (representados por diferentes mutações e protocolos de tratamento), a única conclusão que no momento podemos tirar sobre o prognóstico é que múltiplos factores devem ser considerados quanto a escolha da terapia, e que o efeito dependerá no protocolo utilizado.

O risco de desenvolver leucemia reflete de uma combinação de factores que incluem a predisposição hereditária, as exposições exógenas a agentes com potencial leucemogênicos e, eventos ao acaso. A ocorrência de alterações genéticas, que envolvam genes-chaves para o sistema hematopoiético, está directamente associado a estes factores. Actualmente, estas alterações genéticas são identificadas como marcadores importantes no diagnóstico, para o conhecimento da etiopatogénese da leucemia, e para análises de sobrevida pós-tratamento (1).

A via de sinalização NOTCH é particularmente um alvo muito interessante para pesquisa pela sua relação a uma variedade de cancros. Tendo que o mecanismo da via NOTCH está claramente estabelecido, deve ser considerado que embora NOTCH actue na diferenciação de diversos tipos de células, e conheça-se vários pontos de interferência possíveis no seu mecanismo de sinalização, é preciso desenvolver protocolos de tratamento que minimizem os potenciais efeitos secundários resultantes do bloqueio directo a esta via, enquanto utilizando-se esta inibição específica para aumentar os efeitos anti-cancro, principalmente nas leucemias linfoblásticas agudas de linfócitos T (LLAs-T).

Após a descoberta da alta incidência de mutação no gene NOTCH1 em LLAs-T, este tornou-se um alvo extremamente promissor no tratamento desta doença, especialmente em pacientes que apresentam baixos níveis de prognóstico e altos níveis de recaída seguida de resistência quimioterápica. Assim, várias técnicas de inibição do receptor NOTCH1 foram propostas, sendo a primeira delas, a utilização de um inibidor da gama-secretase (GSIs). Este foi um avanço na área pelo fato de conseguir inibir o receptor NOTCH, bloqueando a transcrição de seus genes-alvo. Porém no caso das LLAs-T, nalgumas linhas celulares foi encontrado resistência ao tratamento, não eliminando totalmente as células leucémicas activadas pela via de sinalização NOTCH. Assim uma melhor compreensão do mecanismo de resistência foi preciso para que houvesse melhores resultados neste tratamento. Deste modo percebeu-se que outras mutações poderiam influenciar no prognóstico desta terapia, levando ao estudo de mutações nos genes PTEN e FBWX7, constatando a sua influência na resistência no tratamento dos GSIs. Sendo assim, uma das idéias propostas para combate a essa resistência seria o uso de alternativas farmacológicas ou estratégias genéticas de forma a restaurar a função desses genes nas células tumorais, sendo uma possibilidade para uma maior efectividade do tratamento.

Outro problema relacionado a utilização dos GSIs, é a presença de toxicidade gastrointestinal, que porém está sendo contornada com a utilização intermitente da droga e a combinação com glucocorticóides. Esta combinação de GSIs e glucocorticóides mostrou ser extremamente eficaz, aumentando os efeitos apoptóticos dos glucocorticóides simultaneamente com a inibição de NOTCH pelos GSIs.

Por causa desses efeitos secundários, novas técnicas foram desenvolvidas com a intenção de inibir NOTCH sem interferir na diferenciação das células gastrointestinais. Assim tratamento com a utilização de anticorpos específicos a NOTCH1 foram desenvolvidos, apresentando uma diminuição considerada na toxicidade gastrointestinal, além de no processo conseguir estudar os efeitos do bloqueio exclusivo deste receptor. Outra técnica relacionada a anticorpos específicos foi desenvolvida, porém desta vez focando em inibir o ligando Delta-Like-4 (Dll4), confirmando os resultados da inibição exclusiva do receptor NOTCH1, e ressaltando a influência deste ligando no processo de vascularização. Sendo este altamente expresso na vasculatura, influência na angiogénese do tumor, desempenhando um efeito anti-tumoral em diversos tipos de cancros.

A última técnica discutida foca no bloqueio do recrutamento dos factores de transcrição, assim foi desenvolvido um péptido chamado SAHM1 que age no complexo NOTCH1-CSL impedindo o recrutamento dos factores de transcrição necessários para a activação dos genes alvos de NOTCH1. Sendo mais uma alternativa no tratamento das LLAs-T em que a princípio não foram observados efeitos secundários.

Os resultados de vários investigadores confirmam que a sinalização NOTCH influencia directamente no potencial de transformação das células em LLAs-T, indicando que o mecanismo de transformação se estende para além de efeitos sobre a diferenciação. As diferentes técnicas abordadas nesta revisão bibliográfica apresentam inibidores da sinalização do receptor NOTCH1 que suprimiram o crescimento, em linhas celulares de LLA-T, perturbando a progressão do ciclo celular e levando a indução de apoptose, abrindo novas possibilidades para o desenvolvimento de terapias específicas.

A introdução de terapias anti-NOTCH em estudos clínicos, pode resultar em melhorias urgentemente necessárias no tratamento, particularmente para os pacientes com doença recidiva. Detalhados estudos analisando as bases genéticas dos tumores, assim como elucidando os mecanismos que medeiam a resposta ao tratamento e os eventos genéticos envolvidos na resistência e recaída, serão fundamentais para definir os próximos passos no sentido de atingir novos e mais eficazes tratamentos. Além disso, numerosos relatórios recentes descrevem o papel da sinalização anormal de NOTCH na patogénese de tumores sólidos e de angiogénese tumoral, sugerindo um papel mais amplo para as terapias dos inibidores de NOTCH.

Logo, a evolução nas técnicas terapêuticas relacionadas com a inibição de NOTCH1, focam a eficácia do protocolo a nível do bloqueio da progressão e erradicação da doença, de preferência evitando os efeitos secundários e o melhor estudo das terapias combinadas com quimioterápicos e outras drogas, fornecendo uma esperança de optimização do tratamento, buscando terapias específicas com perspectivas prognósticas favoráveis direccionadas a vários tipos de cancros, mas principalmente nas LLAs-T.

• 1- Mansur, M. B. Mutações do gene Notch1 e outras alterações moleculares relacionadas à etiopatogênese das leucemias linfoblásticas agudas de linhagem T (LLA-T). Rio de Janeiro, 2008. 102p. Dissertação de Mestrado em Oncologia - Instituto Nacional do Câncer (INCA).

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• 23-  Gedman, A. L. et al. The impact of NOTCH1, FBW7 and PTEN mutations on prognosis and downstream signalling in pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia: A report from the Children"s Oncology Group. Leukemia. 2009; 23(8): 1417-1425.

• 24-  Mansur, M. B. et al. Impact of complex NOTCH1 mutations on survival in pediatric T-cell leukaemia. BMC Cancer. 2012; Jan 6 12:9.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradeço aos meus pais Walmir Batista de Moraes e Rosangela Scaquetti, por todo o apoio e paciência nestes cinco anos de curso, seja no Brasil ou Portugal, sempre me ajudando.

Ao meu orientador, Doutor Nuno Rodrigues dos Santos, que me ajudou com um tema que me incentivou a querer estudar e entender, sempre disposto a ajudar.

Agradeço a minha família, aos meus amigos antigos do Brasil e os mais novos portugueses que fiz nesses últimos dois anos, pelo apoio e distração das responsabilidades académicas.

Autor:

Carolina Scaquetti De Moraes

scaquetti.carol[arroba]gmail.com

UNIVERSIDADE DO ALGARVE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS E MEDICINA

FARO

JULHO DE 2012