Caracterização de ER49, um fator de elongação da síntese de proteínas do tipo Ts, expresso durante a maturação do fruto de tomate

O etileno, conhecido, sobretudo, como o fitormônio da maturação de frutos, está envolvido em vários processos fisiológicos, atuando na regulação da expressão de grande número de genes. O clone parcial de cDNA ER49 foi previamente isolado mediante a técnica do "Differential Display". A obtenção e a análise da seqüência completa confirmaram as homologias significativas com fatores de elongação da síntese de proteínas do tipo Ts. Tais proteínas são responsáveis pela reciclagem do complexo EF-Tu•GDP, que atua na ligação do aminoacil-RNAt ao ribossomo. A predição da seqüência protéica permitiu a detecção de um peptídio sinal de endereçamento para a mitocôndria e dos domínios TS-N e EF-Ts. A modelagem da estrutura terciária mostrou que ER49 poderia interagir com EF-Tu•GDP, para promover a reciclagem de GDP em GTP. Estudos de expressão durante a maturação do fruto de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), var. Micro-Tom, foram realizados por RT-PCR, revelando que ER49 tem sua expressão induzida nos últimos estádios de maturação do fruto. Os resultados da análise do DNA genômico por Southern blot sugerem que ER49 faz parte de uma família multigênica de 2-3 elementos. Através de ER49, gene mitocondrial regulado pelo etileno, surgem novas perspectivas para o estudo da regulação de genes em nível pós-transcricional e de sua relação com o metabolismo respiratório.

Palavras-chave: EF-Ts, etileno, frutos climatéricos, Lycopersicon esculentum, regulação pós-transcricional.

Characterisation of ER49, a Ts type protein synthesis elongation factor, expressed during tomato fruit maturation: The plant hormone ethylene, known as the fruit ripening hormone, plays a role in several physiological processes and is involved in the regulation of gene expression. The partial cDNA clone ER49 was previously isolated by Differential Display screening. Full-length sequence analysis has confirmed significant homologies with TS protein synthesis elongation factors. These proteins are responsible for GDP exchange in the EF-Tu•GDP complex which is necessary for aminoacyl-RNAt binding to ribosome. Peptidic sequence prediction allowed the detection of a mitochondrial targeting signal and TS-N and EF-Ts domains. The modeling of tertiary protein structure has shown that ER49 could interact with EF-Tu•GDP and promote GTP exchange. Expression patterns during tomato fruit ripening (Lycopersicon esculentum Mill.), var. Micro-Tom were obtained by RT-PCR, showing that ER49 is up-regulated in the last stages of fruit ripening. Southern analysis suggested that ER49 is encoded by a multigene family of 2-3 elements. Study of this gene has opened new perspective on the understanding of post transcriptional gene regulation by ethylene and its relationship with the respiratory metabolism.

Key words: climacteric fruits, EF-Ts, ethylene, Lycopersicon esculentum, post-transcriptional regulation, ripening.

A demonstração de que os tecidos vegetais produzem etileno, um hidrocarboneto insaturado de dois carbonos, data de mais de meio século. A partir daí, vários trabalhos demonstraram a implicação desse regulador de crescimento em numerosas fases do desenvolvimento das plantas, como a germinação de sementes, a senescência e abscisão de folhas e de flores, o crescimento e desenvolvimento de raízes e a senescência de folhas e de flores, bem como a embriogênese somática. O etileno, porém, é conhecido, sobretudo, como o fitormônio da maturação de frutos climatéricos (Pech et al., 1992).

Em frutos climatéricos, tais como o tomate, a maçã, o pêssego, a pêra, o melão, o abacate e o quivi (kiwi), o processo de maturação/senescência é acompanhado de um incremento da síntese de etileno e da intensidade respiratória (crise climatérica) (Chitarra and Chitarra, 1990). Durante a maturação desses frutos, as mudanças bioquímicas que ocorrem conferem-lhes suas qualidades organolépticas, o que se traduz pela modificação de cor, textura e sabor (Seymour et al., 1993).

O fenômeno da crise climatérica é acompanhado por mudanças importantes ao nível de expressão de genes, os quais são induzidos pelo etileno (Slater et al.,1985). De fato, vários cDNAs que correspondem a genes que se acumulam em abundância durante a maturação do tomate ou em resposta ao etileno foram isolados (Lincoln et al., 1987; Maunders et al., 1987) e caracterizados (Hamilton et al., 1990; Picton et al., 1993; Gray et al., 1994).

A diversidade e a amplitude das respostas fisiológicas e bioquímicas dos frutos ao etileno sugerem que este fitormônio controla a expressão de grande número de genes, intervindo, em nível molecular, através de uma cadeia de transdução de sinais (Giovannoni, 2001).

Muitos eventos moleculares implicados no processo de maturação dos frutos foram estudados mediante a utilização de métodos clássicos de screening diferencial de bancos de cDNA de frutos maduros. Isolaram-se vários genes, cuja expressão é regulada pelo etileno ou induzidos durante a maturação, mas os conhecimentos sobre a homologia de seqüência com outros genes já caracterizados, mecanismos de regulação e função específica de grande parte deles ainda são insuficientes (Zegzouti, 1997).

Sabe-se que a regulação da expressão gênica pode sofrer intervenções nos níveis transcricional e pós-transcricional. Até agora, somente os mecanismos da regulação transcricional de genes controlados pelo etileno, foram estudados, por meio da caracterização de elementos cis e trans (Bouquin et al., 1997; Coupe and Deikman,1997, Lasserre et al., 1997), restando, ainda, elucidar os eventos relacionados à intervenção do fitormônio na regulação pós-transcricional.

Através da técnica de Differential Display-RT-PCR (DDRT-PCR) (Liang and Pardee, 1992; Zegzouti et al., 1997), identificaram-se 19 novos genes regulados pelo etileno (ER), encontrando-se entre eles, o ER49. A técnica empregada originou clones parciais incompletos, correspondentes essencialmente às extremidades 3'. No caso do clone ER49, a seqüência isolada continha 199 pb na região codificante. As pesquisas de homologia com genes já conhecidos indicaram que o clone em questão corresponderia, potencialmente, a um fator de elongação (EF) da síntese de proteínas do tipo Ts (Zegzouti et al., 1999).