Fungos endofíticos isolados de ápices caulinares de pupunheira cultivada in vivo e in vitro (página 2)

Foram utilizadas pupunheiras, obtidas de matrizes adultas selecionadas no campo, fornecidas pelo Departamento de Produção Vegetal da Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" (Esalq, Piracicaba).

As matrizes foram pulverizadas com fungicida Benomil (10%), para o isolamento da microbiota fúngica endofítica das plantas desenvolvidas no campo. Após uma semana, os palmitos foram coletados e lavados em água corrente, com o auxílio de uma escova, removendo-se as impurezas aderidas à superfície. Em seguida, as bainhas foram retiradas para o isolamento dos ápices caulinares.

Os ápices foram lavados em água corrente por três horas, em frascos tampados com peneira de náilon de espessura média. Em seguida foram desinfestados com água sanitária (hipoclorito de sódio comercial, 30% v/v) por meia hora, e enxaguados abundantemente com água destilada autoclavada. Os explantes foram depositados em placas de Petri contendo papel-filtro, e em seguida colocados em meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1964); foram mantidos em sala de crescimento com temperatura e luminosidade controladas de 26±1ºC e 16 h/luz (fluorescente 36 W/54, 6500 K; irradiância de 15 mmol m^-2 s^-1 ).

A purificação dos isolados foi feita por esgotamento, e seu cultivo se deu, em placas de Petri, com meio de cultura completo (Pontecorvo et al., 1953). Os isolados foram acondicionados em câmara de crescimento (BOD) a 28ºC, no escuro, e sua identificação foi feita por taxonomia clássica e por meio do seqüenciamento dos fragmentos da região de ITS (Internal Transcribed Spacer), segundo o método descrito por Raeder & Broda (1985).

A microbiota fúngica endofítica, existente em plantas micropropagadas há dois anos, foi isolada à medida que os microrganismos surgiam, durante o processo de transferência para novos meios de cultura, ou seja, quando eles se tornavam visíveis, descartando-se todos os microrganismos que surgissem antes de 12 dias, após a transferência, para evitar possíveis contaminções.

Para avaliar a interação entre a microbiota associada à cultura no campo e às plantas micropropagadas, os isolados fúngicos, provenientes das duas condições de desenvolvimento das plantas (in vivo e in vitro), foram cultivados em meio de cultura BDA a 28ºC, por três dias. As suspensões de conídios foram preparadas em Tween 80 (0,1%) e adicionadas ao meio de cultura MS, na concentração de 10³ conídios mL^-1 . Plantas micropropagadas selecionadas de acordo com o vigor, ou seja, plantas com a mesma altura, número de folhas e sistema radicular semelhantes, foram transferidas para esse meio de cultura. Após a reintrodução dos isolados, foi analisada a presença do fungo para saber se alterava o desenvolvimento das plantas.

Os ápices caulinares das plantas adultas cultivadas no campo, que foram colocados in vitro, apresentaram, num intervalo de 12 a 18 dias de cultivo, o desenvolvimento de colônias fúngicas. A classificação taxonômica clássica dos isolados permitiu a identificação no plano de gênero, e o seqüenciamento dos fragmentos de ITS possibilitou a identificação das seguintes espécies: Fusarium sp., F. oxysporum, F. proliferatum, Colletotrichum sp., Alternaria gaisen, Epicoccum nigrum e Neotyphodium sp.

Nas pupunheiras mantidas in vitro há dois anos, e portanto consideradas axênicas, surgiram colônias de fungos, durante o processo de repicagem e transferência para novos meios de cultura, que foram identificados como: E. nigrum, F. oxysporum e Neotyphodium sp. A presença de tais microrganismos, provavelmente, ocorre em conseqüência do estresse da planta, pelo empobrecimento nutricional e alteração do pH do meio de cultura, que antecede a transferência e gera uma redução na resistência da planta, que é aproveitada pelo fungo endofítico que se encontrava em condição de latência. Pereira et al. (2003) afirmam que quando as condições do meio de cultura (nutrição, pH) se tornam favoráveis ao desenvolvimento, as bactérias passam a competir por nutrientes minerais e carboidratos, comprometendo a multiplicação e o desenvolvimento dos cultivos, o que pode levá-los rapidamente à morte.

De todos os isolados fúngicos que foram reintroduzidos em plantas in vitro, Fusarium sp., F. oxysporum, F. proliferatum, Colletotrichum sp. e A. gaisen causaram, após 10 dias, a morte das plantas por apodrecimento do sistema radicular ou tombamento da parte aérea, enquanto E. nigrum e Neotyphodium sp. mantiveram o desenvolvimento normal das plantas.

A atuação do Fusarium é bem estudada em plantas de campo, pois este é um fungo agressivo, responsável pela síndrome da queda dos frutos, assim como outras espécies, tais como: Ceratocystis paradoxa, Colletotrichum gloeosporioides, Cladosporium sp., Aspergillus sp., Verticillium sp., Penicillium sp., Alternaria alternata e Rhizopus sp. (Mota & Gasparotto, 1998). Pizzinato et al. (2001) destacaram a morte de plantas de pupunha, em virtude da ocorrência de Fusarium spp., tanto em viveiro como em campo ou casa de vegetação, constatando a manifestação de sintomas aos sete e dez dias após a inoculação.

O fungo do gênero Epicoccum é caracterizado como onívoro, por se encontrar em uma grande variedade de plantas, no solo, no ar, na pele humana e em insetos. São considerados saprofíticos, mas tornam-se parasitas sob determinadas circunstâncias. Dentre os trabalhos realizados com esse fungo, destacam-se o de Wittig et al. (1997), que observaram o controle da podridão parda do pessegueiro, com o uso de E. purpurascens em casa de vegetação; destaca-se, também o trabalho de Bhuiyan (2003), em que isolados de E. nigrum reduziram sensivelmente doenças fúngicas em sorgo. Cita-se, ainda, o trabalho realizado por Méndez & Mondino (1999), com controle biológico em pós-colheita de frutos e hortaliças, em que E. nigrum foi utilizado em ensaios de antibiose com Sclerotinia sclerotiorum.

A presença dessa espécie de fungo em pupunheira pode ser de extrema importância, uma vez que essa cultura é consideravelmente prejudicada por microrganismos patogênicos, e em ensaios futuros, essa espécie poderá ser utilizada no controle biológico.

Os fungos endofíticos do gênero Neotyphodium, formalmente denominado Acremonium (Glenn et al., 1996), infectam espécies de gramíneas, muitas das quais são importantes forrageiras (Moy et al., 2002). Esses fungos colonizam os espaços intercelulares da parte aérea das plantas, e essa associação endófito-gramínea é geralmente considerada uma simbiose mutualística (Clay, 1988).

Em muitas dessas associações, a produção de alcalóides pelos fungos resulta na redução da herbivoria por insetos ou mamíferos, e isso beneficia a planta hospedeira e os fungos, que por sua vez se beneficiam pelo acesso aos nutrientes produzidos pela planta (Breen, 1994; Bush et al., 1997).

Neste trabalho foi possível observar que o gênero Neotyphodium sp., da mesma forma que o E. nigrum, não afetou o desenvolvimento das plantas micropropagadas. Esses fungos endofíticos, como o "fungus gnats", poderiam ser avaliados, no controle biológico de insetos em pupunheiras, como por exemplo no caso do inseto do gênero Bradysia, cujas larvas penetram nas plântulas e mudas, atingem a região do palmito e atuam de maneira semelhante ao Fusarium (Moro, 1996).

1. A microbiota fúngica isolada de ápices caulinares de plantas adultas de pupunheira pode ser caracterizada como endofítica, pois as plantas não apresentam nenhum sintoma visual de patogenicidade.

2. Após a reintrodução dos isolados fúngicos em plantas axênicas, as espécies Fusarium sp., F. oxysporum, F. proliferatum, Colletotrichum sp. e Alternaria gaisen comportam-se como patogênicas.

3. Os fungos endofíticos E. nigrum e Neotyphodium sp. podem ser utilizados como agentes de controle biológico dos patógenos causadores do apodrecimento radicular de pupunheiras.

Ao Prof. Dr. Marcos S. Bernardes, do Dep. de Produção Vegetal da Esalq, pela doação das plantas de pupunha utilizadas neste trabalho; ao Prof. Dr. João Lúcio de Azevedo, por possibilitar o uso do Laboratório de Genética de Microrganismos da Esalq, para as avaliações moleculares; ao CNPq, pela concessão de bolsas de doutorado e recém-doutor.