Cap. 28 Leningher Tecnología de ADN recombinante
Localizacion, aislamiento, preparación y estudio de pequeños segmentos de DNA: clonación de ADN
Clonación de ADN: fundamentos
Clonar= copias idénticas
Separación de un gen específico o frafmento de ADN de su cromosoma, como resultado hay amplificación selectiva de un gen o fragmento de DNA particular.
5 procedimientos generales (para clonar, obviooo…):
Método para cortar el ADN en localización precisa. El descubrimiento de endonucleasas específicas de secuencia (endonucleasas de restricción).
Método para unir covalentemente 2 fragmentos de DNA. La DNA ligasa puede hacerlo.
Selección de una molécula de DNA pequeña capaz de autorreplicarse. Los segmentos de DNA que se quieren clonar …ver más…

La sonda de DNA radiactiva hibrida solo con el DNA homólogo. La sonda radiactiva hibridada se revela por autorradiografía. Una vez identificadas las colonias marcadas, se usan las colonias de la placa de agar original como fuente de ADN clonado para posteriores estudios.
Placa de agar con colonias de bacterias transformadas  Se presiona con un papel de intracelulosa sobre la placa de agar. Algunas células de cada colonia se pegan al papel.  Papel de nitrocelulosa  El tratamiento con álcali rompe las células y expone el DNA desnaturalizado  DNA unido al papel + Sonda de ADN  Incubación del papel con la sonda radiactiva, y posterior lavado = Sonda hibridada con las colonias de interés y exposición del papel a una película de rayos X.
Se puede amplificar una secuencia de ADN específica
Si se conoce la secuencia de al menos una parte de un segmento de DNA a clonar, se puede facilitar mediante PCR.
Se sintetizan 2 oligonucleótidos, cada uno de ellos complementarios a una secuencia corta de una cadena del segmento de DNA deseado situada junto al extremo de la secuencia a amplificar; estos oligonucleótidos sinteticos se usan como cebadores de la replicación del segmento de DNA in vitro. El ADN aislado del segmento a clonar se calienta brevemente para desnaturalizarlo, enfriándose en presencia de cantidades excesivas de oligonucleótidos sintéticos cebadores.
Es entonces cuando se añaden una DNA poimerasa resistente al calor (TaqI), y los cuatro