Informe de un experimento (extracción de ADN)

Introducción

La práctica la pudimos realizar en una cocina
normal, como se puede realizar en un laboratorio de un centro. La
extracción de ADN requiere hacer varias series de etapas
básicas. En primer lugar tienen que romperse la pared
celular y la membrana plasmática para poder acceder al
núcleo de la célula. Después debe romperse
igual la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por
último hay que proteger el ADN de enzimas que puedan
disminuirlo y para aislarlo hay que hacer que se precipite en
alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en
alcohol se desenrolla y precipita en la interface entre el
alcohol y el agua. Además de permitirnos ver el ADN, el
alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales
son dejados en la solución acuosa. La sal evita la
unión de las proteínas al ADN.

Objetivos

-Realizar la extracción de ADN de tejidos
animales y vegetales y reflexionar sobre la simpleza de su
composición con sencillas técnicas.

– Observar la estructura fibrilar del ADN.

– Establecer la relación entre el proceso de
extracción y propiedades qu?mico-f?sicas del
ADN

Material
necesario

– Muestra vegetal (cebolla, ajó, tomate,
etc.)

– Agua (destilada o mineral)

– Sal de mesa

– Bicarbonato sódico

– Detergente líquido o champú

– Alcohol isoamílico a 0°C

– Batidora

– Nevera

– Colador o centrífuga

– Vaso

– Tubo de ensayo

– Varilla fina

Procedimiento

1.- Preparar el tampón con los siguientes
ingredientes y mantener en la nevera o en un baño de hielo
triturado:

• 120 ml de agua, si es posible destilada y si no
  mineral. No usar agua del grifo.

• 1,5 g de sal de mesa, preferiblemente
  pura.

• 5 g de bicarbonato sódico.

• 5 ml de detergente líquido o
  champú.

2-. Elegir la muestra que va a proporcionar el ADN entre
los vegetales que pueda haber en la cocina (cebolla, ajo,
tomates, etc.) y cortarla en cuadraditos.

3.- Triturar la muestra con un poco de agua en la
batidora accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos. Y
así se romperán muchas células y otras
quedarán expuestas a la acción del
detergente.

4.- Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado
celular con 10 ml del tampón frío y agitar
vigorosamente durante al menos 2 minutos. Separar después
los restos vegetales más grandes del caldo molecular
haciéndolo pasar por un colador lo más fino
posible. Lo ideal es centrifugar a baja velocidad 5 minutos y
después pipetear el sobrenadante.

5.- Retirar 5 ml del caldo molecular a un tubo de ensayo
y añadir con pipeta 10 ml de alcohol isoamílico
enfriado a 0ºC. Se tiene que dejar escurrir lentamente el
alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo éste
inclinado. El alcohol va a quedar flotando sobre el
tampón.

6- Se introduce la punta de una varilla estrecha hasta
justo debajo de la separación entre el alcohol y el
tampón. Remover la varilla hacia delante y hacia
atrás y poco a poco se irán enrollando los
fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto
retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el
ADN quedará adherido a su extremo con el aspecto de un
copo de algodón mojado.

Notas:

• Si se quiere realizar una extracción
  "profesional" puedes agregar enzimas que lo puede hacer
  mejor, y el producto que resultaría seria
  pura.

• Cuando añadas el alcohol frío debes
  hacerlo de forma que resbale por las paredes del tubo para
  que forme una capa sobre el filtrado. Para realizarlo mejor
  puedes utilizar la varilla de vidrio o una cucharilla para
  ayudarte.

• Si se expone por mucho tiempo la muestra vegetal a
  rayos ultravioletas, esto provoca daños sobre la
  estructura del ADN, o aplicar ciertos conservantes que puedan
  provocar efectos sobre la cadena del ADN.

Resultados y
explicación

El producto filamentoso obtenido de la extracción
no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay
fragmentos de ARN. Una extracción "profesional" se realiza
añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de
ARN e impiden que se unan al ADN.

Para realizar una extracción pura ocurrirá
que el detergente contiene lauril sulfato de sodio, el cual
limpia los trastes removiendo grasas y proteínas.
Éste actúa de la misma manera en el protocolo de
extracción de ADN, separando las grasas (lípidos) y
las proteínas que constituyen las membranas que rodean la
célula y el núcleo. Una vez que estas membranas se
han roto, el ADN es liberado de la célula

El calor suaviza los fosfolípidos (grasas) en las
membranas que rodean la célula y el núcleo.
También desactiva (desnaturaliza) a las enzimas
desoxirribonucleicas (ADNasas) las cuales, si están
presentes, pueden cortar el ADN en pedazos tan pequeños
que lo haría imposible de ver. Si las enzimas se
desnaturalizan y el ADN se desenrolla, éste pierde su
forma y se vuelve inactivo. Las enzimas se desnaturalizan a
60° Celsius y el ADN se desnaturaliza a 80°
Celsius.

Los zumos de piña y papaya contienen un enzima,
la papaína, la solución ablandadora de carne
también actúa como una enzima, que contribuye a
eliminar las proteínas que puedan contaminar el ADN. La
solución ablandadora de carne actúa como una
enzima.

El ADN se precipita en el alcohol fuera de la
solución, donde puede ser visto. Además de
permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros
componentes celulares, los cuales son dejados en la
solución acuosa.

El proceso de extracción de ADN desde una
célula es el primer paso para muchos procedimientos
(protocolos) de los laboratorios de
biotecnología.

Los científicos deben ser capaces de separar
suavemente el ADN de sustancias no deseadas que se encuentran en
las células, evitando que el ADN se desnature (que se
rompa).

El material que se necesita para ello es fácil de
encontrar y el procedimiento es sencillo .Cada uno de los
ingredientes tiene su propia función. La solución
de sal y jabón sirve para romper la membrana
plasmática y nuclear e incluso la pared celular. El
líquido de lentillas elimina las proteínas que
degradan el ADN. El alcohol etílico sirve para precipitar
el ADN

-EL ADN

El ADN constituye el material hereditario de un
individuo. En él están escritas las instrucciones
que deben seguir las células para construir un organismo y
mantenerlo vivo. Todas las células que forman un individuo
contienen una copia idéntica de ADN. Cada una de ellas,
sin embargo, lee una parte de estas instrucciones y por eso hay
células con diferentes formas y funciones.

Está formado por desoxirribonucleotidos (A, G, C,
T). Que a su vez están formados -D desoxirribosa y un ion
fosfato.

La proporción y secuencia de las bases
nitrogenadas diferencia a los poli nucleótidos.

El ADN presenta dos niveles de plegamiento que dan lugar
a:

Estructura primaria:

Los polinucleótidos se forman entre las bases
nitrogenadas de adenia, guanina, citosina y timina por enlaces
covalentes de tipo fosfodiester. Así se forma un esqueleto
de polidesoxiribosa-fosfato, de forma que queda un extremo con
-OH 3´ libre y un extremo 5´ con un grupo fosfato
libre.

Estructura secundaria:

Tiene un empaquetamiento espacial pero no se
altera.

Dentro de la estructura secundaria hay 3
modelos:

El modelo de la estructura secundaria del ADN en forma
de doble hélice dextrógira (forma B). Las dos
hebras son anti paralelas es decir si una presenta la
dirección 5´->3´, la otra posee la
dirección 3´->5´.

El conjunto se pliega sobre sí mismo obligado por
los puentes de hidrógeno entre diferentes regiones de la
molécula, hasta adoptar la conformación más
estable, que es la de doble hélice. Este enrollamiento
entre las 2 hebras de la doble hélice es dextrógiro
es decir gira a derechas y de tipo plectonémico, como si
estuvieran trenzadas.

Las secuencias de bases son complementarias, pues hay
una correspondencia entre las bases de ambas cadenas .La adenina
sólo puede estar frente a la timina y la guanina frente a
la citosina. Así las bases púricas están
enfrentadas a las bases pirimidínicas y la unión se
realiza por puentes de hidrógeno en los pares A=T y tres
en los pares G-C

La correspondencia entre las bases es la causa de que
las dos cadenas de la doble hélice de ADN posean
secuencias complementarias.

Además los pares de bases están
horizontales y el eje los atraviesa por el centro.

Modelo hélice A: En este modelo los pares de
bases nitrogenadas están inclinados hacia el exterior pero
la hélice al igual que la del ADN B es
dextrógiro

Modelo hélice z: En este modelo las cadenas de
ADN no se enrollan en forma de doble hélice sino en forma
de zig-zag.

ADN es la abreviatura del ácido
desoxirribonucleico (en inglés, DNA). Constituye el
material genético de los organismos. El ADN es una
molécula que se encuentra en todas las células de
los seres vivos y se encarga de codificar todo lo que nosotros
formamos o somos, desde nuestro color del pelo hasta las
proteínas que tenemos en nuestra sangre. El ADN es una
molécula cargada que está asociada a
proteínas y en el caso de los organismos eucariontes
está encerrado dentro de un núcleo.

El ADN está presente en los indicios
biológicos como sangre, semen, saliva, hueso, pelo,
etc.

Es muy importante conocer las condiciones para
remisión adecuada de la muestras.

El Salting- out es uno de los métodos de
extracción de ADN mas utilizados por su fácil
implementación, baja toxicidad de los reactivos y permite
la visualización del ADN.

-Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza
del ADN:

• Cantidad de material de partida

• Número de copias de las moléculas de
  AN

• Cantidad de tejido.

• Condiciones en las que se encuentra el material de
  inicio(fresco, congelado, fijado)

• Contaminantes e interferentes en el material
  biológico

Conclusión

Al realizar el procedimiento adecuadamente, resulta que
las fibrillas de ADN comenzaron a salir, de un color blanco
precipitado por sobre el alcohol (mezcla Heterogénea). Con
un alambre doblas y obtenemos y sacamos del tubo de ensayo el
ADN. Si quieres conservar el ADN puede dejarse secar sobre un
papel de filtro.

En caso de que el ADN de la Muestra Vegetal no se pueda
apreciar muy claramente. Tenemos que agitar el tubo un poco para
poderlo apreciarlo mejor.

Si se tiene problemas con el filtro, que no está
bien hecho y que no filtra bien, por lo tanto hay que hacer otro.
También puede haber complicaciones con la forma de poner
el alcohol de manera que cayera por las paredes del tubo de
ensayo.

Con esto podemos saber cómo es el procedimiento
del extracto del ADN, así como si estructura de una forma
fácil y sencilla.

Bibliografía

http://learn.genetics.utah.edu/es/units/activities/extraction/

http://html.rincondelvago.com/extraccion-del-adn-de-una-cebolla.html

http://centros5.pntic.mec.es/ies.victoria.kent/Rincon-C/Practica/PR-5.htm

http://www.joseacortes.com/practicas/extraccionADN.htm

http://www.jpimentel.com/ciencias_experimentales/pagwebciencias/pagweb/la_ciencia_a_tu_alcance_II/quimica/Experiencias_quimica_extraccion_de_adn.htm

http://www.bioapuntes.cl/laboratorio/extrac-adn.htm

Autor:

Arnulfo Salas Betancourt