Determinación de la capacidad biodegradadora de hidrocarburos aromáticos policiclicos de los hongos (página 2)

Dentro de las fuentes de carbono importantes para este
trabajo de investigación se puede mencionar la Glucosa,
Sacarosa, y como fuentes de carbono sustitutivas está el
Crudo de Petróleo y los Hidrocarburos Aromáticos
Policíclicos (HPAs).

Glucosa

Es un monosacárido que tiene seis átomos
de carbono como se puede observar en la figura #04, es el
monosacárido originario del que se derivan muchos
más. La D-glucosa es el combustible principal para la
mayor parte de los organismos, y es también la unidad
estructural básica de los polisacáridos más
abundantes, tales como el almidón y la celulosa
(Lehninger, 2005).

Figura # 04. Estructura química de
la D-Glucosa. Fuente: Lehninger, 2005

Sacarosa

Comúnmente conocida como azúcar de
caña, es un disacárido de la Glucosa y de la
Fructosa. Abunda sobremanera en el reino vegetal y es familiar
como azúcar de mesa. Al contario de muchos
disacáridos y oligosacáridos, la sacarosa no
contiene átomo de carbono anomérico libre; los de
ambas hexosas se hallan unidas entre sí. La sacarosa, por
tanto, no experimenta mutarrotación ni reacciona con la
fenilhidracina para formar osazonas, ni siquiera es un
azúcar reductor. La hidrólisis de la sacarosa a
D-glucosa y D-fructosa se denomina frecuentemente
inversión, ya que va acompañada de un cambio neto
de rotación óptica, de dextro a levo, en cuanto se
ha producido la mezcla equimolar de glucosa y de fructosa; esta
mezcla se denomina frecuentemente azúcar invertido. La
hidrólisis de la sacarosa que es catalizada por la enzima
invertasa observar la figura #05 (Lehninger, 2005).

Figura # 05. Estructura química de la sacarosa.
Fuente: Lehninger, 2005

Hongos

Son talófitos carentes de clorofila y de sistema
vascular que, por su estructura vegetativa y su sistema de
reproducción, se diferencian de las algas y aun más
de las plantas superiores. Características
morfológicas fundamentales los separan también de
las bacterias, pues son organismos constituidos de muchas
células, todas provistas de núcleos típicos.
En la mayoría de los hongos el cuerpo vegetativo consiste
en numerosos filamentos alargados, tabicados o no, denominados
hifas, y el conjunto de estas recibe el nombre de micelio.
Existen dos tipos de micelio: en uno la presencia de tabiques
divide a las hifas en muchas células independientes y es
característico tanto de formas superiores (ascomicetes y
basidiomicetes) como inferiores (deuteromicetes); el otro, con
hifas indivisas, es decir cenocíticos, es propio de los
ficomicetes, que presentan unas de las clases menos evolucionadas
de este grupo. Entre los hongos más frecuentes
están: Penicillium, Zygorhynchus, Fusarium, Mucor,
Aspergillus y Rhizopus. Hanson JR. (2008).

Claves de identificación de los
hongos

Existen claves de identificación de hongos, las
cuales en su mayoría son dicotómicas. Entre las
principales características macroscópicas de
identificación se encuentran diámetros de las
colonias, coloración del anverso y reverso de las mismas,
presencia de esclerocios, presencias de gotas de exudados,
presencia de pigmentos difusibles y textura de las colonias. Y
como principales características microscópicas de
identificación se pueden mencionar disposición de
las médulas o filiadas sobre la vesícula, longitud
y anchura de los estipes, forma y diámetro de las
vesículas, longitud y anchura de las médulas o
filiadas, forma, diámetro, ornamentación y color de
los conidios, forma, tamaño y color de las células
de Hulle, forma, tamaño y color de las ascosporas. Hanson
JR. (2008).

Hongos Ligninolítico

Son aquellos que han desarrollado un sistema
enzimático único y no específico que
funciona en el ambiente extracelular. El mecanismo del sistema
degradador de lignina está basado en la producción
de radicales libres. Este mecanismo permite que estas enzimas
sean catalíticamente activas sobre una gran diversidad de
sustratos orgánicos. La enorme diversidad estructural de
los contaminantes que son degradados por estos hongos, les
confiere un uso potencial en biorremediación. Estos hongos
han sido efectivos en la degradación de una diversidad de
contaminantes ambientales peligrosos (Davila, G. Vázquez,
R 2006).

Lignina

Según (Davila, G. Vázquez, R 2006) la
lignina, después de la celulosa, es el mayor componente de
la materia vegetal y la forma más abundante de material
aromático en la biosfera. La madera y otros tejidos
vasculares contienen alrededor del 20-30% de lignina (Lin, S. Y,
Dence 1992). La mayor parte de ésta se encuentra dentro de
las paredes celulares, entremezclada con las hemicelulosas y
formando una matriz que rodea las ordenadas microfibrillas de
celulosa. Este compuesto provee de rigidez a las plantas
superiores ya que actúa como pegamento entre las fibras de
celulosa formando la lámina media (Kirk, T. K, Farrell
1987). Además, protege a los carbohidratos
fácilmente degradables (celulosa, hemicelulosa) de la
hidrólisis enzimática microbiana, (Fritsche, W.
Hofrichter, M. 1999). Ver la figura #06

Figura # 06. Estructura parcial de la lignina
Fuente: Higuchi (1990)

Enzimas ligninolíticas de
hongos

Según (Davila, G. Vázquez, R 2006) A
partir de los estudios realizados con hongos
ligninolíticos en los años setenta, se
comprobó que la degradación de la lignina daba
lugar a productos que provenían de la ruptura oxidativa de
anillos aromáticos. Por lo que se pensó que las
oxigenasas extracelulares podían estar involucradas en la
transformación de la lignina (Kirk, T. K, Chan, G. 1975).
Algunos años después, tres grupos reportaron de
manera independiente, el descubrimiento de una ligninasa capaz de
oxidar y despolimerizar la lignina y compuestos modelo (Glenn, J.
K, Morgan 1983), y cuya actividad enzimática depende del
peróxido de hidrógeno (HB2BOB2B). Se calcularon
pesos moleculares de entre 41-42 kDa y se encontró que
contenía un grupo prostético hemo, (Tien, M. Kirk,
T.1984). Estudios espectroscópicos mostraron que esta
ligninasa era distinta de las oxigenasas P450, compartía
algunas características con las hemoproteínas
transportadoras de oxígeno y que era en realidad una
peroxidasa (Kirk, T. K., Ferrell, R. L.1987). A esta enzima se le
denomina ahora como lignino peroxidasa (LiP).

A partir de este hallazgo, se encontró la
producción de dos hemoperoxidasas más: la manganeso
peroxidasa (MnP) que oxida el MnP2+P a la especie oxidante MnP3+P
(Gleen, J.K., Gold, M.H.1985), mientras que recientemente en los
géneros Pleurotus y Bjerkandera se ha
descrito una MnP versátil (VP). Esta enzima conjuga las
propiedades catalíticas de LiP y MnP (Heinfling, A.,
Ruiz-Dueñas, F.J., Martínez, M. J.
1998).

Además de estas peroxidasas, se detectó la
producción en estos hongos ligninolíticos de una
cuarta enzima, una fenol oxidasa denominada lacasa. Esta enzima
reduce el oxígeno molecular a agua, y a través la
utilización de ciertos compuestos redox puede ser capaz de
ampliar su espectro de sustratos, logrando así la
oxidación de porciones no fenólicas de la lignina
(Bourbonnais, R., Paice, M. G.1990).

Estas enzimas ligninolíticas pueden actuar
separadas o en cooperación, dependiendo de si el hongo es
capaz de producir una o más.

Lignino peroxidasa (LiP) y manganeso peroxidasa
(MnP)

Estas dos peroxidasas involucradas en la
despolimerización de la lignina fueron descritas por
primera vez en el hongo ligninolítico P.
chrysosporium. De este organismo se han purificado diez
isoenzimas, nombradas H1 a H10, de acuerdo a su orden de
elución de una columna de intercambio aniónico. De
ellas, seis fueron identificadas como isoenzimas de LiP, mientras
que cuatro correspondieron a isoenzimas de MnP. Ambas son capaces
de oxidar a la lignina, y derivados de la misma, además de
una variedad de compuestos modelo, (Wariishi, H. Valli, K.
1991).

Estas enzimas comparten la estructura del grupo
prostético férrico protoporfirina IX (grupo hemo)
presente en su sitio activo. Normalmente en las hemo peroxidasas,
el átomo de hierro se encuentra penta coordinado. Cuatro
posiciones de coordinación son ocupadas por los
átomos de nitrógeno de los anillos
pirrólicos. La quinta posición se localiza en el
lado proximal (por "debajo") del grupo hemo y es
comúnmente ocupada por un nitrógeno perteneciente
al anillo imidazol de un residuo de histidina. La sexta
posición de coordinación en la enzima en su estado
basal está vacante y se ubica en el lado distal (por
"arriba") del grupo hemo. Esta cavidad distal es la región
en la que ocurren muchas de las reacciones de las
hemoperoxidasas.

A pesar de la baja homología en secuencia entre
diversas peroxidasas (menor al 20%), el plegamiento y la
estructura secundaria se encuentran conservadas (Banci, L.1997).
La enzima se divide en dos dominios estructurales (proximal y
distal) que envuelven al grupo prostético y su estructura
está conformada principalmente por 10-11
a-hélices.

Las LiP presentan masas moleculares de aproximadamente
40 kDa, están glicosiladas y tienen puntos
isoeléctricos y pH óptimos ácidos.
Además su ciclo catalítico es común para
diversas peroxidasas (Wariishi, H. Valli, K. 1991).

Peroxidasa versátil (VP)

Según (Davila, G. Vazquez, R 2006) Como se
mencionó, tanto la (LiP) como la (MnP) fueron descubiertas
en cultivos del hongo P. chrysosporium y estudiadas
extensivamente. Recientemente se describió una tercera
peroxidasa ligninolítica en los géneros
Pleurotus y Bjerkandera. A esta enzima se le
denominó versátil peroxidasa (VP). La VP, diferente
de la MnP y LiP de P. chysosporium, es capaz de oxidar
Mn2+ a Mn3+, y catalizar reacciones sobre sustratos
aromáticos en ausencia de Mn2+ (Martine, M. J, Ruiz.1996).
Además se encontró que posee una alta afinidad
hacia el Mn2+, hidroquinonas y colorantes. También es
capaz de oxidar al alcohol veratrílico (a veratril
aldehído), dimetoxibenceno y dímeros de lignina,
aunque con menor afinidad que la LiP (Caramelo, L.
Martínez, M. 1999).

El ciclo catalítico de la VP combina los ciclos
de la LiP y la MnP . Sus características básicas
son comunes a la mayoría de la peroxidasas. Sin embargo,
la VP es única ya que es capaz de oxidar sustratos
aromáticos como el alcohol veratrílico (AV) a su
correspondiente radical AV•, el Mn2+ a Mn3+ y sustratos que
la LiP sólo oxida en presencia de alcohol
veratrílico. El ciclo de la VP incluye la
sustracción de dos electrones de la enzima en estado basal
por el peróxido de hidrógeno para producir el
compuesto IA (C-IA), que contiene un oxo-Fe IV=O y un radical
catiónico en la porfirina. La reducción en dos
reacciones de un electrón produce el compuesto IIA
(C-IIA), que contiene un oxo-Fe IV=O. Y después, la forma
basal de la enzima. El ciclo también incluye el compuesto
IB (C-IB), que contiene un oxo-Fe IV=O y un radical
triptófano (Trp•) y el IIB (C-IIB), que contiene un
Fe III y un Trp• involucrado en la oxidación de AV y
otros compuestos aromáticos de alto potencial redox (C-IB
y C-IIB están en equilibrio con C-IA y C-IIA,
respectivamente). El porcentaje de las formas A y B en las dos
reacciones puede ser variable y su participación en la
catálisis dependerá de los sustratos disponibles.
En otras palabras, los compuestos IA y IIA predominarán
durante la oxidación de Mn2+, mientras que un porcentaje
del Trp• será necesario durante la oxidación
de AV. El triptófano activo en C-IB y C-IIB es el W164 en
la VP de P. eryngii (Pérez-Boada, M.
Ruiz-Dueñas, F. 2005).

Es importante mencionar que esta enzima oxida
directamente hidroquinonas y fenoles sustituidos, los cuales no
son oxidados eficientemente por la LiP o la MnP en ausencia de
veratril alcohol o Mn2+, respectivamente. Incluso oxida
colorantes de alto potencial redox, los cuales solo son
catalizados por la LiP en presencia de veratril alcohol
(Heinfling, A. Martínez, M. 1998). Para esta enzima, los
pH óptimos para la oxidación de Mn2+ y sustratos
aromáticos son diferentes. Para la oxidación de
Mn2+ el óptimo es pH 5, mientras que para los compuestos
aromáticos y colorantes es 3. Estos parámetros son
similares a los de MnP y LiP, respectivamente (Martínez,
A. T.2002).

Lacasa

Según (Davila, G. Vazquez, R 2006) Las fenol
oxidasas son enzimas que catalizan la oxidación de un
amplio espectro de compuestos fenólicos y aminas
aromáticas utilizando el oxígeno molecular como
aceptor de electrones, reduciéndolo a agua (Shah, V.
Nerud, F. 2002)

La lacasa es una fenol oxidasa que debe su nombre a que
fue descubierta, hace más de un siglo, en el árbol
japonés de la laca: Rhus vernicifera (Yoshida, H.
1883). Esta enzima contiene átomos de cobre y se encuentra
ampliamente distribuida en las plantas superiores, diversas
clases de hongos y algunas bacterias (Gianfreda, L., Xu, F.,
Bollag, J. M.1999). Todas las lacasas son glicoproteínas
extracelulares [78] con pesos moleculares entre 60 y 80 kDa, y
del 15 al 20% de su peso molecular esta dado por carbohidratos,
(Shah, V. Nerud, F. 2002).

La lacasa fúngica (bencendiol: oxígeno
oxidorreductasa es una fenol oxidasa extracelular producida por
el micelio de basidiomicetos, ascomicetos y deuteromicetos,
(Bollag, J.M. Leonowicz, A.1984) Los mejores productores de esta
enzima son los hongos ligninolíticos (Leonowicz, A., Cho,
N. S. 2001). Bioquímicamente, la lacasa es una enzima que
oxida una variedad de compuestos aromáticos. Cataliza la
remoción de un electrón y un protón de
hidroxilos fenólicos o de grupos amino aromático,
para formar radicales libres fenoxilo y radicales amino,
respectivamente. Este grupo de enzimas, posee cuatro
átomos de cobre en su estado de oxidación 2+ que
les confieren una coloración azul.

Esta enzima oxida no solamente ácidos
fenólicos y metoxifenólicos, sino que
también los descarboxila, (Agematu, H., Shibamoto, N.
1993) y ataca sus grupos metoxilo mediante la
desmetilación (Leonowicz, A. Edgehill, R. U. 1984) o
desmetoxilación (Potthast, A., Rosenau, T. 1995). Todas
estas reacciones pueden representar un paso importante en la
transformación inicial de la lignina.

La lacasa también reacciona con polifenoles y
otros compuestos aromáticos derivados de la lignina, los
cuales, pueden ser polimerizados o despolimerizados, o incluso
actuar como mediadores redox de bajo peso molecular,
(Bourbonnais, R., Paice, M. G. 1995). La utilización de
sistemas mediador-lacasa es una alternativa promisoria para
procesos biotecnológicos con aplicaciones ambientales.
Entre ellos, los de blanqueo de la pulpa de papel [84, 85], la
decoloración de colorantes textiles, (Rodriguez, E.,
Pickard, M. A. 1999) y la oxidación de hidrocarburos
polinucleoaromáticos (Pickard, M. A., Román,
R.1999)

Los compuestos como el pireno, benzo(a) pireno,
acenafteno, fenantreno, antraceno y fluorantreno pueden ser
oxidados por enzimas como la LiP (Hammel, K. E.1986), la MnP
(Bogan, BW, Lamar RT.1995) la VP (Wang, Y., Vazquez-Duhalt R.,
2003) y la lacasa, (Johannes, C. Majcherczyk A. 2000).

La habilidad de estas enzimas para oxidar los HPAs
depende del potencial de ionización (PI) de cada
compuesto.

Hidrocarburos.

Definición de Términos
Básicos

Adaptación: Adquisición de factores
para vivir en un entorno particular en el curso de la
evolución. Pérez, G. Zarate, P. (2010).

Agar: El agar-agar es un solidificante que se
utiliza en la mayoría de los medios de cultivo ya que no
tiene valor nutritivo para los microorganismos. Pérez, G.
Zarate, P.(2010).

Agua Destilada: Es aquella que como todo tipo de
agua su composición se basa en la unidad de
moléculas H2O, solo que se le han eliminado las impurezas
e iones mediante la destilación. Depool, B.
(2010)

Asa: Un asa siembra o asa bacteriológica
es un instrumento de laboratorio tipo pinza que consta de una
base de platino, acero, aluminio y un filamento que puede ser de
nicromo, tungsteno o platino que termina en aro o en punta.
Pérez, G. Zarate, P. (2010).

Aseptado: Micelio sin esporos. Pérez, G.
Zarate, P. (2010).

Asexual: Estado anamorfo, reproducción sin
intervención de cariogamia y meiosis. Pérez, G.
Zarate, P. (2010).

Asimilación: La habilidad para usar una
fuente de carbono o nitrógeno para crecer con
oxígeno. La asimilación es leída como la
presencia o ausencia de crecimiento. Pérez, G. Zarate,
P.(2010).

Aspergillus: Es un género de
alrededor 200 hongos (mohos), y es ubicuo. Es un hongo
filamentoso compuesto de cadenas de células llamadas
hifas. Antequera, A. (2010)

Basidia: Una estructura portando sobre su
superficie un número definido de basidiosporos
generalmente 4. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Basidiosporo: Un esporo que nace sobre la parte
exterior de una basidia que desarrolla por cadiogamia y meiosis.
Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Biomasa: Es el nombre dado a cualquier materia
orgánica de origen reciente que haya derivado de animales
y vegetales como resultado del proceso de conversión
fotosintético. La energía de la biomasa deriva del
material vegetal y animal, tal como madera de bosques, residuos
de procesos agrícolas y forestales, y de la basura
industrial, humana o animales. Pérez, G. Zarate,
P.(2010).

Caja de Petri: Es un recipiente de vidrio
consistiendo de una caja plana, circular con lados verticales y
una cubierta similar, pero ligeramente más grande que se
fija sobre ella; es un equipo modelo para el crecimiento de
microorganismos en cultivo puro. Pérez, G. Zarate,
P.(2010).

Carbohidratos: Son los compuestos
orgánicos más abundantes de la biosfera y a su vez
los más diversos. Normalmente se los encuentra en las
partes estructurales de los vegetales y también en los
tejidos animales, como glucosa o glucógeno. Estos sirven
como fuente de energía para todas las actividades
celulares vitales. Joint, W. (2003)

Cámara de Neubauer : Es un instrumento
utilizado en medicina y biología para realizar el recuento
de células en un medio líquido, que puede ser un
cultivo celular, sangre, orina, líquido
cefalorraquídeo, líquido sinovial, etc.
Rodríguez, M. (2008).

Colonia: Es un grupo de individuos de la misma
especie viviendo en cerrada asociación; en hongo se
refiere usualmente a muchas hifas creciendo de un punto y
formando un talo redondo o globoso. Pérez, G. Zarate,
P.(2010).

Compuestos: Son sustancias formadas por la
combinación de elementos. Los compuestos pueden
descomponerse en los elementos por medios químicos
apropiados. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Conidia: (algunas veces se conoce como conidio
esporas), son no móviles y se forman en las puntas de
hifas especializadas llamados conidióforos. Algunos hongos
forman una sola conidía mientras que otros forman cadenas
de esporas asexuales. Pérez, G. Zarate, P.
(2010).

Conidióforo: Hifa especializada que da
origen o aporta conidios. Pérez, G. Zarate,
P.(2010).

Consorcio Microbiano: Es un grupo de diferentes
especies de microorganismos que actúan conjuntamente como
una comunidad, en un sistema complejo donde todos se benefician
de las actividades de los demás. Medina, M. et al
(2000).

Cultivo: Es el recurso didáctico
más sensible y especifico, es por eso que es el
método más usual, se utiliza para el crecimiento e
identificación de agentes infectantes. Pérez, G.
Zarate, P.(2010).

Densidad óptica: Es la absorción de
un elemento óptico por unidad de distancia, para una
longitud de onda dada. Pérez, G. Zarate,
P.(2010).

Ecología: Ciencia enfocada en el
comportamiento natural de los hongos. Pérez, G. Zarate,
P.(2010).

Enzimas: Son moléculas de naturaleza
proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que
sean termodinámicamente posibles: Una enzima hace que una
reacción química que es energéticamente
posible pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea
cinéticamente favorable, es decir, transcurra a mayor
velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones,
las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas
sustratos, las cuales se convierten en moléculas
diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las
células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas
significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las
denomina reacciones enzimáticas. Dávila, G.
Vásquez, R. (2006).

Especie: La unidad de clasificación; un
grupo de individuos estrechamente relacionados, semejando unos a
otros en ciertas características. Pérez, G. Zarate,
P.(2010).

Esporas: Espora en biología designa un
mecanismo reproductivo, generalmente haploide y unicelular. La
reproducción por esporas permite al mismo tiempo la
dispersión y la supervivencia por largo tiempo en
condiciones adversas. La espora produce un nuevo organismo al
dividirse por mitosis sin fusión con otra célula,
produciendo un gametofito pluricelular. La espora es parte
importante de los ciclos vitales biológicos de plantas,
hongos y algas. El término deriva del Griego Antiguo
sp??a, semilla. Las esporas se pueden clasificar según su
función, estructura, origen del ciclo vital o por su
movilidad. Hanson JR. (2008)

Esporo: Unidad de reproducción y de
mantenimiento de la especie de los hongos. Pérez, G.
Zarate, P.(2010).

Estipe: El tallo de un basidiocarpo o ascosporo.
Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Estrategia ecológica: Ciclo de vida
optimizado por la relación devector/reservorio para la
supervivencia de la especie en un hábitat determinado.
Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Exudado: Son gotitas que se forman sobre la
superficie de la colonia. Pérez, G. Zarate,
P.(2010).

Fitoplancton: Es el conjunto de los organismos
acuáticos autótrofos del plancton, que tienen
capacidad fotosintética y que viven dispersos en el agua.
El nombre proviene de los términos griegos, f?t??
(phyton, "planta") and p?a??t?? ("plánktos",
"vagabundo" o "el que va dando tumbos") Thurman, H.
(1997).

Fructificación: Cualquier estructura
fungal que contenga o porte esporos o conidias. Pérez, G.
Zarate, P.(2010).

Género: Una categoría
taxonómica que incluye un número de especies.
Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Hábitat: Ambiente donde residen los
hongos. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Hidrocarburos: Son compuestos que solo contienen
dos elementos, hidrogeno y carbono. Partiendo de su estructura,
se dividen en dos clases principales: Alifáticos y
aromáticos.

Hifa: Elemento vegetativo de un hongo.
Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Inocular: Introducir en el medio, organismo por
medios artificiales, una pequeña cantidad de un producto
que contiene bacterias y que se toma, por ejemplo, para hacer un
cultivo, una resiembra o infectar determinados animales de
experimentación. Pérez, G. Zarate,
P.(2010).

Inóculo: Adición e un producto en
el sentido estricto o bacterias crecidas en un fermentador
aisladas del mismo sitio donde se van a aplicar. Pérez, G.
Zarate, P.(2010).

Micelio: Término colectivo para un grupo o
masas de hifas. Pérez, G. Zarate, P. (2010).

Peptona: Cualquiera de las sustancias producidas
por la transformación de las albúminas mediante la
acción de la pepsina contenida en el jugo gástrico.
Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Petróleo: El petróleo es una mezcla
que, se presenta en la naturaleza compuesta predominantemente de
hidrocarburos en fase sólida, líquida o gaseosa;
denominando al estado sólido betún natural, al
líquido petróleo crudo y al gaseoso gas natural,
esto a condiciones atmosféricas. Pérez, G. Zarate,
P.(2010).

Proteínas: Son macromoléculas
compuestas por carbono, hidrógeno, oxígeno y
nitrógeno. La mayoría también contienen
azufre y fósforo. Las mismas están formadas
por la unión de varios aminoácidos, unidos mediante
enlaces peptídicos. El orden y disposición de los
aminoácidos en una proteína depende del
código genético, ADN, de la persona. Kerstetter, J.
et al (2005).

Reino Protista: También llamado
Protoctista, es el que contiene a todos aquellos organismos
eucariontes que no pueden clasificarse dentro de alguno de los
otros tres reinos eucarióticos: Fungi (hongos), Animalia
(animales) o Plantae (plantas). En el árbol
filogenético de los

organismos eucariontes, los protistas forman varios
grupos monofiléticos separados, o incluyen miembros que
están estrechamente emparentados con alguno de los tres
reinos citados. Se les designa con nombres que han perdido valor
en la ciencia biológica, pero cuyo uso sería
imposible desterrar, como «algas»,
«protozoos» Cavalier, T. (2006).

Rhizopus: Es un género de mohos
que incluyen especies cosmopolitas de hongos filamentosos
hallados en el suelo, degradando frutos y vegetales, heces
animales, y residuos. Zheeng, R. (1998).

Quinona: Es uno de los dos isómeros de la
ciclohexanodiona o bien un derivado de los mismos. Su
fórmula química es C6H4O2. Dávila, G.
Vásquez, R.(2006).

Septado: Son cruces de paredes. Pérez, G.
Zarate, P. (2010).

Septo: Un cruce de pared en una hifa.
Pérez, G. Zarate, P. (2010).

Sustrato: Medio en el que se desarrollan una
planta, un animal o un microorganismo fijo. Pérez, G.
Zarate, P. (2010).

CAPITULO III

Marco
metodológico

Tipo de investigación

Según Fidias Arias (2006) una
investigación de tipo descriptiva consiste en la
caracterización de un hecho, fenómeno, individuo o
grupo con el fin de establecer su estructura o comportamiento,
ubicándose los resultados de este tipo de
investigación en un nivel intermedio en cuanto a la
profundidad de los conocimientos se refiere.

Mediante el concepto anterior, se podría decir
que esta investigación es de tipo descriptiva ya que no
solo consiste en la determinación de las especies
fúngicas presentes en las aguas de la zona en estudio,
sino también su capacidad. Además de lo antes
mencionado se clasifica como investigación correlacional,
ya que se tratara de establecer el comportamiento biodegradador
de las especies fúngicas en relación a la
concentraciones de hidrocarburos. Pérez, G. Zarate, P.
(2010).

Diseño de la
Investigación

La estrategia general de diseño de
investigación es del tipo experimental ya que consiste en
someter el objeto de estudio a variables, condiciones controladas
y conocidas por el investigador para observar los resultados que
cada variable ejerce sobre el objeto bajo estudio (Sabino C,
2001). En la realización de la investigación
experimental se manipularon los datos obtenidos mediante la
creación de condiciones de laboratorio para determinar el
potencial biodegradador de la microflora fúngica,
así como también su comportamiento en diferentes
medios de cultivos y aguas libres de contaminantes. Tal como en
este proyecto se mostraron registros de los diferentes resultados
obtenidos en las pruebas de laboratorio y el estudio
continúo de dichos hongos.

Población y muestra

Población

Según Chávez (1991), una población
es finita cuando está conformada por menos de cien mil
elementos, siendo la cantidad de especie de hongos degradadores
de hidrocarburos conocidos menor a esta cantidad, razón
por la cual en esta investigación se estará
trabajando con una población finita.

La población objeto de esta investigación
son las especies fúngicas biodegradadoras localizada en
las aguas superficiales de Punta Cardón, Amuay y las aguas
superficiales de la playa El Pico.

Muestreo

La muestra es un subconjunto representativo de la
población, se utilizara un muestreo no
probabilístico, ya que según Sampieri (1998) se
tiene que este es aquel en que no sigue el proceso aleatorio,
estos se caracterizan porque el investigador selecciona sus
muestras siguiendo algunos criterios que le permitan realizar
dicha investigación.

Para determinar la cantidad de muestreo para este
trabajo se tomo en cuenta la cantidad de kilómetros de
costa en la zona y los sectores donde se observaba posible
contaminación por hidrocarburos, a partir de allí
se determinaron por dos estaciones con 4 puntos de muestreo para
cada zona (Punta Cardón y Amuay) y otra estación
con un solo punto en la playa El Pico como zona fuera del
área de influencia.

Sistema de Variables

Variable Independiente; medios de cultivo,
condiciones de temperatura, pH, concentración de
antraceno

Variable Dependiente; metabolización del
antraceno.

Se establecieron las variable de esta manera debido a
que para que se observe la metabolización del antraceno
(Variable Dependiente), se necesitas que los hongos se
desarrollen o crezcan en ambientes que los favorezcan como las
temperaturas cálidas donde su velocidad de crecimiento es
mayor que en bajas temperaturas y en pH básicos,
además de la capacidad de contaminante (antraceno) que
puedan soportar.

Instrumentos y técnicas de recolección
de datos

Loa valores de temperatura y pH se midieron en el campo,
mientras que el oxigeno disuelto, salinidad, conductividad,
sólidos en suspensión y sólidos totales
fueron calculados a través de las normas COVENIN para
aguas. Los valores para determinar las concentraciones de
antraceno se realizaron a través de
espectrofotometría U.V.

Entre las técnicas utilizadas para la
recolección de datos se encuentran la revisión
bibliográfica de apuntes escritos tales como revistas,
patentes, artículos científicos y textos
especializados, así como también trabajos de
investigación y artículos publicados en Internet,
el principal instrumentos de recolección de datos son las
tablas.

Fases de la
Investigación

Fase I: Toma de Muestras

Se colectaron 9 muestras, determinadas de esta manera
debido a los kilómetros de costa que abarca cada zona
tomando las muestras en las cercanías a las
refinerías, donde se observaba posible
contaminación con hidrocarburo, dichas muestra fueron
repartidas en, 4 estaciones para la zona sur de playa de Amuay y
4 estaciones para la zona norte en Punta Cardón, y una
estación de muestreo en playa el pico como zona no
influenciada. Se realizaron dos campañas de muestreo en
las cuales se tomaron 27 muestras por campaña para un gran
total de 91 muestras, las cuales fueron separadas en tres grupos,
uno para los análisis fúngicos, la otra para
espectrofotometría, dichas muestras fueron colectadas en
recipientes de vidrios de 475 ml previamente esterilizados en un
autoclave (ver anexo #13 pág. 86) a 15 Psig y 121ºC
durante 30 minutos, protegidos con tapas seguras y recubiertas
con papel estéril y la tercera para los análisis
fisicoquímicos, las cuales se colectaron en recipientes de
plástico de color ámbar de 1litro previamente
curadas. Para visualizar mejor esta información pueden
observar la figura #07, y los anexos del 1 al 10 ubicados en la
páginas desde la 80 a la 84.

El tipo de muestreo es simple con un patrón de
muestreo de transepto, con una frecuencia de una vez por semana
durante dos (2) semanas, dichas muestras se tomaron en aguas
superficiales, debido a que la mayoría de los
hidrocarburos se concentran en la superficie del agua formando
una película de aceite que impide el proceso
fotosintético el cual desoxigena el agua y altera el
ecosistema. Se cuantificaron, la cantidad de hidrocarburos que se
encontraron en dichas zonas, para lo que se establecieron dos (2)
tipos de muestras: una (1) la, muestra problema y la segunda (2)
el blanco que corresponde a una muestra que se tomo fuera del
área de influencia del sitio en estudio.

Con la finalidad de darle mayor solides al estudio, y
para determinar el ambiente en viven las especies
fúngicas, no solo se analizó la posible presencia
de aromáticos policíclicos, sino que también
se evaluaron los siguientes parámetros físicos y
químicos: temperatura a la cual se colectaron las
muestras, el pH del ambiente marino en el momento de la
selección muestrearía, oxigeno disuelto,
sólidos totales en suspensión así como el
contenido de salinidad.

Figura # 07 Ubicación
geográfica del área de muestreo.

Fase II: Identificación y
Cuantificación de las especies fúngicas
provenientes de las muestras colectadas

En esta fase se preparó Agar Sabouraud con 5
gramos de peptona, 20 gramos de glucosa, 20 gramos de agar
pesados en una balanza (ver anexo #12 pág.) en 1 litro de
agua destilada. Se esterilizaron a 15 libras de presión
121 grados centígrados por 15 minutos. Se prepararon un
total de 18 placas de Petri, 9 para cada muestreo, a las cuales
se le agregaron 15 ml de la solución preparada, como las
muestras fueron por triplicado a las placas se les realizó
por el lado reverso una división de tres partes iguales,
donde se sembraron dichas muestras de agua colectadas en las
zonas de estudio.

Al transcurrir una semana se observó crecimiento
de microorganismos entre ellos hongos los cuales se aislaron en
tubos de ensayos con la solución preparada de agar
Sabouraud en cuñas, en una campana de flujo laminar (ver
anexo#11, pág. 85)

Después de una semana se aplico el método
de Riddel: se tomó una placa de Petri por cada hongo,
dentro de esta placa se colocó una varilla de vidrio en
forma de U, y encima de esta una lámina porta objeto con
un cuadrito de 1cm2 de agar Sabouraud al cual se le
inóculo el hongo en estudio, luego se colocó una
lámina cubre objeto y para proporcionarle humedad y se
facilite la esporulación se le agregaron 8cc de agua
esterilizada y se tapó. Estas placas se incubaron a
temperatura ambiente hasta que ocurrió la
esporulación, allí se tomó la lámina
con el hongo y se identificó con el microscopio
electrónico del laboratorio LIADSA/UNEFM.

En esta fase se llevo a cabo el crecimiento de los
hongos, según el método descrito por Klich y Pitt
(1988), a partir de las muestras elegidas, para luego identificar
las características macroscópicas y los
parámetros fisicoquímicos.

Los resultados obtenidos se trataron aplicando
estadística descriptiva, con un modelo aleatorio, como la
T de Student

Fase III: Cuantificación de la capacidad
biodegradadora de las especies fúngicas identificadas en
el estudio y observar su comportamiento durante 20
días

De las cepas encontradas se seleccionaron tres, y se
sembraron en cuña cuatro botellas de vidrio transparente
de 1 litro previamente esterilizadas, con 120 ml de Agar de papa
para cada hongo, siendo en total 12 botellas.

Para la realización del ensayo de
biorremediación se colectaron 88 botellas de vidrio
transparentes de 250 ml, donde 24 de ellas se les agregó
20 ml de Czapek líquido con sacarosa, a 32 botellas 20 ml
de Czapek liquido con 150 ppm de antraceno como fuente de carbono
y otras 32 botellas con 20 ml de Czapek liquido y con 300 ppm de
antraceno, luego se procedió a esterilizar todas estas
botellas.

Una vez hecho esto se procedió a sacar todas las
esporas de los hongos sembrados en las botellas de 1 litro,
agregándole 25 ml de agua destilada y estéril a
dichas botellas para raspar toda la cuña de hongo visible,
de allí se procedió a realizar el respectivo conteo
de esporas usando la cámara de Neubauer( ver anexos #14 y
15 en la pág. 86, 87) , obteniendo valores entre 106 y 108
para cada hongo, tomando en cuenta que los resultados fueron
favorables, se tomaron 2 ml de estas esporas para inocularlas en
las botellas de 250 ml ya mencionadas anteriormente exceptuando
16 que eran el blanco en las diferentes concentraciones de
antraceno

Dichas botellas se dejaron en observación durante
20 días, donde cada 5 días se destapaban 22 para
determinar la cantidad de antraceno y el peso de los hongos,
estas 22 botellas equivalen a 6 botellas de Czapek con 150 ppm 2
por cada hongo, 6 botellas de Czapek con 300 ppm 2 por cada
hongo, 6 botellas con Czapek liquido y sacarosa con el fin de
verificar que los hongos estuvieran vivos, y las 4 botellas
restantes son los blancos debidos a que 2 llevan Czapek liquido
con 150 ppm de antraceno sin hongo y las otras 2 llevan Czapek
liquido con 300 ppm de antraceno sin hongo. observar anexo #25 y
26 en la pág. 92

A todas las botellas se les realizaron técnicas
analíticas con el fin de determinar la
concentración química de hidrocarburos totales
(THs) presentes en las muestras y sometida a un proceso de
extracción líquido – líquido con n- hexano
agregándole 15 ml por cada botella con la finalidad de
extraer el antraceno y leer el extracto en el
espectrofotómetro y el líquido restante se
filtró para determinar la masa fúngica. observar
anexo #27 y 28 en la pág. 93

Nota: El medio Czapek líquido fue
preparado con agua de mar.

Fase IV: Simular a nivel de laboratorio muestras
contaminadas con antraceno y exponer las especies fúngicas
seleccionadas anteriormente a dichas muestras

En esta fase se colectaron cuatro (4) botellas de vidrio
de 2 litros, las cuales fueron preparadas para la
realización del simulacro por alrededor de dos meses y
medio, en dos botellas se le agregaron ½ litro de agua de
mar con 150 ppm de antraceno y una de ellas se le agrego 50 ml de
un consorcio de los 3 hongos ya seleccionados. A las 2 botellas
restantes se les agregaron ½ litro de agua de mar con 300
ppm de antraceno y una de ellas se le agrego 50 ml de un
consorcio de los 3 hongos seleccionado.

Al transcurrir los dos ( 2) meses y medio se
procedió a realizar la extracción liquido –
liquido con n- hexano con el fin de extraer el antraceno y leer
el extracto en el espectrofotómetro y el líquido
restante se filtró para determinar la masa
fúngica.

CAPITULO IV

Resultados y
análisis

Determinación de las
características fisicoquímico in
situ

Los puntos de muestreo seleccionados en Punta
Cardón, se identificaron como P1, P2, P3, P4, los de Amuay
como A1, A2, A3, A4 y en la playa El Pico como MB, estos
resultados de los parámetros fisicoquímicos se
pueden observar en la tabla numero 1y 2.

Tabla Nº 4 Determinación de las
características fisicoquímico in situ
(Primer Muestreo)

Fuente: Cáceres J. Lara H.
(2011)

Tabla N° 5 Determinación de
las características fisicoquímico in situ
(Segundo Muestreo)

Fuente: Cáceres J. Lara H. (2011)

Con los valores observados en la tabla numero 4 y 5
correspondientes al primer y segundo muestreo respectivamente,
los parámetros fisicoquímicos determinados in
situ, se puede decir que estos valores son actos para el
crecimiento de la microflora fúngica debido a que estas
tienen un crecimiento acelerado en temperaturas cálidas y
pH básicos.

Determinación de las características
fisicoquímicas en el Laboratorio

Parte del volumen de las muestras colectadas fueron
analizadas en el laboratorio químico CICBA/UNEFM para
determinar el contenido de oxigeno disuelto, sólidos
totales, sólidos en suspensión, conductividad,
salinidad, estos resultados se pueden observar en las tablas
número 6 y 7

Tabla Nº 6 Características
fisicoquímicas en el Laboratorio

(Primer muestreo)

Fuente: Cáceres J. Lara H.
(2011)

Tabla Nº 7 Características
fisicoquímicas en el Laboratorio

(Segundo muestreo)

Fuente: Cáceres J. Lara H.
(2011)

En términos generales los valores arrojados con
comunes, y al no tener una norma para compararlos se puede decir
que estos parámetros son aceptables, existe buena
presencia de oxigeno vital para la vida marina entre ellos loa
microorganismos fúngicos, donde los mismos toman la
salinidad como nutrientes para su sobrevivencia.

Aislamiento de las especies fúngicas presentes
en el agua

En la tabla Nº 8, se presenta a continuación
el conteo de colonias de hongos aislados en los dos muestreos de
agua colectada en la Costa Oeste de la Península de
Paraguaná.

Tabla N° 8. Unidades Formadoras de
Colonias (UFC)

Fuente: Cáceres J. Lara H.
(2011)

En el primer muestreo las unidades formadoras de
colonias fueron más abundantes que en el segundo debido a
que en éste ultimo algunas de las placas sembradas con
agua de mar para el aislamiento fueron contaminadas por
abundantes bacterias que impidieron el crecimiento de hongos como
se puede observar en la tabla anterior en el punto A2

Identificación de las especies fúngicas
encontradas

Las especies fúngicas encontradas en las muestras
de agua colectadas de los 9 puntos de estudio se identificaron
macroscópicamente por observación directa y
microscópicamente por medio del estudio morfológico
de micro-cultivos, como se pueden observar en la tabla Nº
6.

Tabla N° 9.
Características macroscópicas y
microscópicas de las especies
fúngicas

Fuente: Cáceres J. Lara H.
(2011)

En la tabla numero 9 se puede observar que de los 27
hongos aislados, 14 son del genero Aspergillus de
especie níger, 9 del genero Rhizopus de
especie ssp y 4 del genero Aspergillus y de
especie flavus, predominando en un 51,85% el
Aspergillus níger .