Introducción:
La a-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la
saliva humana y cataliza la degradación del
almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal.
El almidón está formado por dos tipos de
moléculas: la amilosa y la amilopectina, ambos
polisacáridos de glucosa. La
amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por
enlaces a- C1-C4, mientras que la amilopectina tiene,
además de estos últimos enlaces, uniones C1 con C6,
formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4,
tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas
lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos.
Para medir la actividad enzimática de la a-amilasa, se
utilizará un test
colorimétrico que detecta el almidón. Para ello se
contará con una solución de iodo/ioduro de potasio
(I2/IK), ya que el almidón en presencia de esta
solución adquiere una coloración azulada
característica. Esto tiene una explicación física: el iodo se
coloca en el interior de la hélice que forma la amilosa
(en las regiones hidrofóbicas), formando un complejo de
color azul.
Cuando la a-amilasa actúa, degrada la amilosa, se
desintegra la hélice y por tanto en presencia de
I2/IK ya no dará una coloración
azul.
Por lo tanto, en este TP mediremos la desaparición de
sustrato (evidenciada por el test colorimétrico) para
determinar la actividad de la enzima. Además, analizaremos
cómo afectan las distintas condiciones en que actúa
la enzima (pH, temperatura,
concentración de NaCl), así como los efectos que
pueden causar diferentes pretratamientos (proteinasa, calor).
La dilución óptima nos indicará
cuánto debemos diluir la saliva para que se logre el
efecto acromático dentro del rango propuesto (2-8
minutos).
Metodología:
Se partió de una muestra de saliva
de un integrante del grupo y se la
recogió en un vaso de precipitado que se colocó en
un recipiente con hielo para reducir la energía
cinética (para disminuir el contacto de las
moléculas, reduciendo las interacciones químicas
que se pudieran producir) de compuestos presentes en la saliva
que puedan afectar el funcionamiento de la proteína.
A partir de la muestra, se tomó una alícuota
para impregnar un papel indicador de pH sobre un papel blanco. El
pH obtenido fue entre 7-8. Desde aquí, el trabajo se
dividió en dos partes: una para determinar la
dilución óptima y el tiempo de
referencia y la otra, modificando una de las condiciones
experimentales.
Parte 1:
Se tomó 1 ml de saliva de la muestra del vaso de
precipitados y se lo diluyó con 9 ml de agua destilada
en un tubo de ensayo,
obteniendo una dilución 1/10. Luego se mezcló por
inversión, evitando que la solución
adquiera energía cinética y se produzca la
desnaturalización de la enzima de nuestro interés; y
se lo colocó en hielo, por la misma razón antes
expuesta.
Se preparó una gradilla con 15 tubos, conteniendo cada
uno una solución (de coloración amarilla) de 5 ml
de agua de la canilla y una gota de I2/IK 0,01M, que
se mezcló por agitación para obtener una
solución homogénea. Luego, se nos entregó
una solución de almidón 1% p/v a baño
térmico a 37° C (para que conforme una solución
homogénea). Se extrajeron 6 gotas con pipeta Pasteur de la
solución de almidón y se la volcó en un tubo
0 de la gradilla, mezclándolo por inversión y
obteniendo un color azul característico del complejo
Iodo-almidón.
Prontamente, se colocó en el tubo con almidón 1
ml de la dilución 1/10 de la saliva (que contiene a
ααamilasa) y en ese instante se comenzó a
cronometrar. A los 30 segundos, se retiraron 6 gotas de esta
solución a 37° C donde debía ocurrir la
reacción y se las agregó al tubo 1 de la gradilla.
Este procedimiento se
debería haber repetido cada 30 segundos para los
siguientes tubos hasta que la muestra adquiriera un color
parduzco, sin embargo, ya en el tubo 1, al mezclarlo por
inversión con un tapón de goma, se obtuvo una
coloración parda. Como el efecto acromático
explicado en la introducción se había dado antes de
los 2 minutos, era evidente que la dilución 1/10 no era la
óptima. Por eso, se decidió una nueva
dilución 1/50. Para obtener esta dilución, se
tomó 1 ml de la 1/10 de saliva y se la colocó en un
tubo de ensayos con 4
ml de agua destilada, mezclándolo por inversión. Se
repitió el procedimiento anterior de la medición de la reacción
enzimática y de esta manera se determinó el tiempo
de referencia para la dilución 1/50, que será la
dilución óptima.
Parte 2:
A cada grupo se le asignó un tratamiento distinto para
analizar la actividad de la enzima alterando las condiciones
anteriores (modificando una sola variable).
Nuestro grupo recibió una solución NaCl 0,1 M
para analizar los efectos de la presencia de NaCl sobre la
ααamilasa.
Para realizar estar parte, se trabajó con una
dilución de saliva al doble de la dilución
óptima (es decir, 1/100 de saliva).
Se pipetearon 0,5 ml de la dilución 1/50 de saliva para
mezclarlos por inversión con 0,5 ml de NaCl.
Se repitió el procedimiento realizado en la parte 1 y
se encontró el tiempo en el que se logró el efecto
acromático para la saliva diluida con NaCl. No obstante,
este tiempo no se puede comparar con la dilución 1/50 de
la saliva puesto que se trata de diluciones de saliva distintas.
Por lo tanto, se elaboró una medición control (con el
mismo procedimiento anterior pero partiendo de una
dilución 1/100 de saliva en agua destilada sin NaCl). Para
la medición control se realizaron 17 tubos.
Resultados:
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