Cáncer de colon rectal hereditario no poliposo (HNPCC) Síndrome de Lynch (página 2)

Materiales y métodos.

En el desarrollo del
trabajo
practico realizamos un análisis genético, donde evaluamos
la heterogenicidad del alelo del gen hMLH1, para esto realizamos
una PCR para amplificar el exon 16 y verificar la presencia de la
delecion de las 3 bases que producen la perdida de una lisina en
la proteína.

Reacción de PCR:

  Se realizaron cuatro reacciones de PCR, un
control positivo
para la delecion del gen (en solo uno de los dos alelos, es decir
en heterocigosis), un control negativo para la delecion, un
control negativo para la PCR sin añadir DNA (con agua) para
comprobar la ausencia de contaminantes en los reactivos de PCR, y
por ultimo se realizo una reacción con la muestra
incognita.

Para la amplificación por PCR los primers
utilizados fueron:
hMLH1e16 sense:
CATTTGGATGCTCCGTTAAAGC
hMLH1e16
antisense: CACCCGGCTGGAAATTTTATTTG
La PCR se
realizo con un volumen final de
25ul con:

H2O a 25ul de volumen final

Los ciclos realizados fueron:
Desnaturalización inicial: 12min a 95ºC
Melting 30seg a 95ºC
Annealing 30seg a 55ºC
Elongación 60seg a 72ºC
Elongación final por 10 min a 72ºC

Las muestras obtenidas luego de la reacción de
PCR fueron resueltas en un gel de poliacrilamida al 5%. Las
muestras fueron corridas a 98volt en buffer TBE 1X con el
marcador de peso pUC19.

Protocolo de preparación del gel de
poliacrilamida:
Acrilamida/Bisacrilamida 5%
TBE5X  1X
APS 10% 0.04%
TEMED 100%      0.1%
Agua destilada para llegar a 10ml

Los grupos 1, 2 y 3
realizaron la reacción de PCR con cuatro tubos de
reacción un control positivo un control negativo un
control de PCR (agua) y una muestra incógnita. Los grupos
4, 5, 6 y 7 realizaron tres reacciones de PCR con loo siguientes
controles, control positivo, control negativo y control H2O.
Estos fueron sembrados en tres geles de poliacrilamida y fueron
corridos por 1hs 30 min. Luego fueron teñidos para su
posterior visualización con bromuro de etidio, y fueron
fotografiados en el transiluminados con luz
UV.

Resultados:

En el gel 1 se sembraron las muestras desde la calle 1,
sembró el grupo 1 las
muestras del control positivo, control negativo, control H2O y
muestra incógnita (respectivamente). Luego el grupo 2
siguió en el mismo orden. Podemos observaren el gel 1 la
calle correspondiente a el control positivo para la
mutación en condiciones heterozigotas (calle 1) presenta
una doble banda bastante difusa. El control negativo (calle2)
presenta una doble banda con lo que podemos suponer que se
produjo una contaminación o se mezclaron las muestras
de DNA, ademas observando el control agua (calle 3) donde no se
deberia ver ninguna banda encontramos una banda clara y bien
definida.

En la calle 4 la cual contiene la muestra
incógnita se ve una banda muy tenue. Suponiendo que el
resultado de la muestra incógnita es el correcto y no
ocurrio como con las calles 2 y 3, la persona es
homocigoto el locus que se esta estudiando, no pudiendose
discriminar entre homocigoto wild-type y homocigoto
mutante. Para la siembra realizada por el grupo 2 en el control
positivo (calle 5) encontramos una unica banda, donde
debería haber dos, en el control negativo y en el control
agua (calles 6 y 7) no encontramos aparición de bandas por
lo que se descarta la posibilidad de una contaminación con
DNA. En la calle correspondiente al control negativo
debería haber una banda. En la calle conteniendo la
muestra (calle 8) no hay ninguna banda por lo cual se asume que
no había DNA íntegro en la muestra utilizada, o que
se cometió algún error en la PCR.

Figura 1 – Corrida en gel de poliacrilamira. Gel
1

En el gel 2 se sembraron las muestras
del grupo 3 el orden control positivo, control negativo, control
H2O y muestra, el grupo 4 sembró el control positivo, el
control negativo y el control agua, ya que del grupo 4 al 7 solo
realizaron estas reacciones de PCR. En este gel se observa que la
calles correspondientes al control positivo (calles 1 y 5)
presentan en una y dos bandas respectivamente. En el caso de la
calle 1 debiera observarse dos bandas, la banda presente es
demasiado tenue, por lo cual se puede pensar que si la
amplificación hubiese sido mayor, quizas se observase la
segunda banda. Las calles correspondientes a los controles
negativos (calles 2 y 6) se observan una banda en cada una como
es esperable. Mientras que en las dos calles correspondientes a
control agua (Calle 3 y 7) se observan bandas muy tenues las
cuales pueden deberse a contaminación de los componentes
de la PCR o a contaminación durante la siembra de las
muestras en el gel.

Figura 2 –
Corrida en gel de poliacrilamira. Gel 2

En el gel 3 sembraron el grupo 5, 6 y 7 las muestras en
el orden control positivo, control negativo, control agua
respectivamente. En las calles 1, 4 y 7 correspondientes a los
controles positivos, donde se deberían observar dos
bandas, debido a la heterocigozidad, se observan una banda, dos
bandas y dos bandas tenues respectivamente. En el primer caso se
podría ver la aparición de la segunda banda si se
continúa hasta obtener una mayor amplificación. En
los controles negativos (calles 2, 5 y 8) se observan dos bandas,
en las tres calles, lo cual no es el resultado esperable. Esto
puede deberse a que se realizó una mala siembra en el gel
de poliacrilamida, o a contaminación con muestra de DNA
positiva para la mutación en uno de los dos locus. En las
calles correspondientes a control de agua (calles 3, 6, y 9) se
observan, nada, dos bandas claras y dos bandas tenues
respectivamente. Estos resultados, salvo en la calle 3 no son
esperables, en las mismas puede haberse contaminado las muestras
con DNA heterocigota.

Figura 3 –
Corrida en gel de poliacrilamira. Gel 3

Conclusiones:

En el desarrollo del trabajo
práctico no se logró determinar por medio de PCR
entre los organismos incógnitas para la mutación
cuasal del HNPCC. Los organismos portadores de la
mutación en condiciones de heterocigocidad
deberían haber presentado dos bandas como producto de
la PCR con los primers específicos. La de menor peso
molecular de las dos bandas, correspondiente a las dos hebras
del genotipo wild-type unidas entre sí o a las
dos hebras del genotipo mutante unidas entre sí. No
pudiéndose discernir entre ambos pares de hebras unidos,
debido a la resolución del gel de poliacrilamida y a que
la diferencia entre ambas cadenas es de solamente tres pares de
bases. Mientras que la banda que corre como si tuviera un mayor
peso molecular correspondería al heteroduplex formado
por la hibridización entre una banda mutante y una banda
wild-type. Este heteroduplex corre menos ya que se
formaba un loop debido a que tres nucleótidos
presentes en una de las bandas no estaban presentes en la otra
de ellas.

En el desarrollo de este trabajo práctico se
obtuvieron muchos resultados no esperados, como bandas simples
en muestras de organismos heterocigotas, bandas dobles en
muestras de organismos homocigotas, bandas presentes en los
controles de agua, etcétera. Estos resultados se pueden
deber principalmente a la falta de experiencia en el trabajo
de laboratorio
y a la falta de organización entre los alumnos de cada
grupo y entre los diferentes grupos. A pesar de estos
resultados con el desarrollo del trabajo práctico se
puedo tomar conocimiento
de otra de las aplicaciones de la reacción en cadena de
la polimerasa, que en este caso, tiene como finalidad la
detección de heterocigotos para la mutación que
genera el NHPCC, y así determinar el riesgo que
tiene una persona de contraer la patología.

Ayelen Rapoport

Esteban Hernando

Fabián A. Shalóm

Cátedra de Genética
Humana – Instituto de Inv. Biotecnológicas –
Univ. Nac. de San Martín

Av. General Paz 5445, INTI, Edificio 24 , Prov. de Bs.
As.

Octubre de 2007