Protoplastos vegetales, aislamiento y cultivo

Los protoplastos son células vegetales que han
sido separadas de su pared celular mediante un tratamiento
enzimático o mecánico y adoptan forma
esférica en el medio de cultivo (Fig. 1).

Fig. 1 Protoplastos
vegetales

http://ruisoares65.pbworks.com/w/page/24326349/Protoplastos

Tiene propiedades y aplicaciones
interesantes:

• Pueden multiplicarse y desarrollar estructuras
  similares a embriones y desde ellos, plantas
  adultas.

• Permite chequear células en vez de plantas
  enteras para seleccionar una característica ventajosa
  (ej. Resistencia o tolerancia a un herbicida).

• Las células vegetales se pueden hacer crecer
  en un medio liquido en el laboratorio o en grandes
  biorreactores, como fuentes de productos secundarios tales
  como medicamentos u otros productos industriales.

• Pueden fusionarse con protoplastos de otros tipos o
  especies, obteniendo híbridos somáticos incluso
  de especies sexualmente incompatibles. La fusión de
  protoplastos también perite el intercambio de
  orgánulos citoplasmáticos y la
  recombinación génica entre genomas
  mitocondriales o clroplásticas diferentes.

• Pueden incorporar nuevos genes mediante vectores
  adecuados (virus, plásmidos, microinyecciones,
  fusiones de protoplastos…). Podemos chequear el
  resultado del constructo génico en el protoplasto o
  regenerar la planta. Estos transgenes permiten a las plantas
  modificar y mejorar sus características ( Ej. Mayor
  resistencia a plagas, rango de salinidad mas amplio, mejores
  características organolépticas,..).

• Permiten obtener líneas celulares dihaploides
  a partir de cultivos haploides. Se hace con un tratamiento
  con colchicina que origina la no separación de los
  núcleos hijos tras la duplicación del
  número de cromosomas. Los dihaploides generan
  líneas homocigotas rápidamente, interesantes en
  programas de multiplicación [1]

El primer aislamiento de protoplastos vivos fue el
descrito por Klerccker (1892), quien tuvo éxito al aislar
protoplastos de cebolla usando métodos mecánicos.
El primer aislamientos por métodos enzimáticos se
hizo en células de levadura, utilizando jugo
gástrico del caracol Hélix pomotia (Giaja,
1919); aunque en ese momento no se conocía el mecanismo de
degradación enzimática de la pared celular, las
observaciones de este trabajo fueron importantes ya que el
método permitió aislar altas cantidades de
protoplastos.

Aislamiento de
protoplastos

1.2 Método mecánico: El cual
posee un bajo rendimiento, es un procedimiento tedioso y presenta
una aplicabilidad limitada. Consiste básicamente en un
choque osmótico para producir plasmólisis celular y
ruptura de la pared. Los protoplastos se liberan de las
células rotas mediante el restablecimiento de su nivel
osmótico.

1.3 Método enzimático: Consiste en
la incubación de las células en una mezcla de
enzimas que degradan la pared celular: celulasas, hemicelulasas y
pectinasas. Las preparaciones comerciales de dichas enzimas
contienen además proteasas, nucleasas y
lipasas.

Los principales factores que se deben considerar para el
éxito de este método son:

• El tipo de enzimas que se usaran.

• La composición del medio en que ellas
  actuarán.

• El material de origen de los
  protoplastos.

Cultivo de
protoplastos

El cultivo de protoplastos es un método en
cultivo de tejidos donde se puede originar variación
somaclonal para el desarrollo de nuevos tipos de plantas.. Se han
desarrollado técnicas especiales con la finalidad de
liberar protoplastos desnudos desde los confines de sus paredes y
permitir que cada protoplasto individual pueda regenerar en
cultivo de tejido hacia una planta.

2.1Sistema de Cultivo

Para inducir la división de los protoplastos
aislados y la formación de sus colonias, se han
desarrollado diferentes sistemas de cultivo. Generalmente, los
protoplastos se cultivan en cajas de Petri plásticas en un
medio liquido, o en uno solidificado con agar o agarosa. El medio
liquido tiene la desventaja de que , a menudo presenta
dificultades para aislar las colonias derivadas de una
célula, mientras en el medio sólido los
protoplastos inmovilizados producen clones celulares; se
requiere, sin embrago, una manipulación manual para
transferidos a otro medio.

El medio liquido se usa colocándolo en capas
delgadas o en gotas de 50 a 250 &µl (kao et al., 1971).
El medio sólido se una mezclando en él los
protoplastos cuando tenga de 35 a 40 °C, y
depositándolo, en capas delgadas, en las cajas de Petri
(Nagata et al,. 1971). Las cajas de Petri se sellan con parafilm
y se cultivan en la oscuridad o en la luz difusa a una
temperatura de 24 a 28°C.

Los medios adecuados para el cultivo de protoplastos
siguen generalmente el modelo de los utilizados para el cultivo
de células in vitro; a menudo se han desarrollado
diferentes modificaciones, pero básicamente deben tener
componentes como sales inorgánicas, estabilizadores
osmóticos, reguladores de crecimiento, extractos naturales
como (levadura, CH, aminoácido, vitaminas, ácidos
orgánicos, azucares entre otros.

Fig.2 Aislamiento y Cultivo de
protoplastos (Centro Internacional de Agricultura Tropical
(CIAT)

Finalmente, la metodología básica para la
manipulación y extracción de protoplastos consisten
en 5 pasos: Aislamiento, purificación,
determinación de viabilidad (Toma de oxigeno, actividad
fotosintética y tinciones), cultivo (Medio de cultivo MS o
B, solido o liquido, osmolaridad, densidad de plaqueo,
condiciones de almacenamiento, y material vegetal) y
regeneración (Organogénesis y
embriogénesis). La fuente del material, los tratamientos
pre-enzimáticos y enzimáticos y la osmolaridad son
factores que afectan la producción y viabilidad de los
protoplastos.

Hibridación somática de
protoplastos

La hibridación somática es una
técnica que puede permitir que diferentes especies de la
misma familia sean cruzada, representa una opción para
transferir características que se encuentran en las
especies silvestres hacia las especies cultivadas, la
fusión de protoplastos facilita el flujo genético
entre las especies que permite superar las barreras para la
hibridación sexual interespecífica. De igual forma,
esto es usualmente imposible siguiendo el proceso normal de
regeneración sexual de las plantas. Estableciendo cultivos
de protoplastos de cada especie, los cultivos pueden ser
mezclados y algunos protoplastos de cada especie se
fusionarán al azar. Por una cuidadosa selección y
cultivo, se podrán regenerar plántulas desde estos
protoplastos híbridos y ser ensayados por
características deseables in vivo.

Fig.3 Hibridación
somátics

Referencias

[1] ALONSO J. R. 2011. Manual de
Histología Vegetal. Ediciones Mundi-Prensa. Pág.
252.
Fuente:http://books.google.com.co/books?id=URwHpBfK_68C&pg=PA252&dq=protoplasto+vegetales&hl=es&ei=Qz1ZT7raD46-gAfnz4WjCw&sa=X&oi=book_result&ct=book-
humbnail&resnum=7&ved=0CFEQ6wEwBg#v=onepage&q=protoplasto%20vegetales&f=false

[2] L. Szabados. Protoplastos: aislamiento, cultivo y
regeneración de plantas. Fuente:
http://webapp.ciat.cgiar.org/biotechnology/cultivo_tejidos/capitulo10_parte1.pdf

Autor:

Juan Gabriel Albornoz