Camino de señalización de EGFR (página 2)

1-Construcción de biblioteca de
cDNA en humanos

Para la construcción de esta biblioteca de cDNA
humano, partimos de un cultivo de células
Hela (linaje de células de carcinoma de cervix humano,
verdaderamente «inmortales») y realizamos una lisis
de las células y simultánea extracción de
mRNA a través de una columna de afinidad a la cual se
encuentra fija una secuencia complementaria a la cola poli A de
los mensajeros maduros(Oligotex Direct mRNA Mini Kit,
Qiagen). Este kit permite obtener mRNA intacto directamente de
las células Hela.

Una vez obtenidos los mRNAs, proseguimos con la
obtención del cDNA. Dado que el fin de la obtención
de cDNA es su clonado para lograr la expresión de las
proteínas que se expresan en esta
línea celular humana, es conveniente que la síntesis
del cDNA sea la apropiada para llevar a cabo un clonado
direccionado. Es por ello que fue utilizada la estrategia que se
esquematiza a continuación.

Figura 1. Esquema de
síntesis de cDNA para realizar un clonado
direccionado.

Por empezar, se utiliza un oligo(dT)18
100M, al cual se le ha añadido a su extremo
3’OH libre un oligonucleótido (Operon Technologies)
que contiene la secuencia de corte para la enzima de
restricción XhoI. La síntesis de oligodT-XhoI es
realizada por Operon Technologies.

La reacción siguiente es la incubación de
ese primer oligodT- Xho I con el RNAm ya purificado para realizar
la reacción de retrotranscripción con el kit
conteniendo la M-MulV RT (Fermentas). Esta enzima permite
sintetizar la primera cadena de cDNA provenientes de mensajeros
largos. Dado que el cDNA total puede contener secuencias de corte
para alguna de las enzimas de
restricción utilizadas, es preciso que, para evitar su
corte posterior, esta síntesis se realice en presencia de
un nucléotido metilado ,5–metil dCTP, (Fermentas,
dNTP mix 10mM each).

El oligodT-Xho I se sintetizó con arreglo al mapa
del sitio múltiple de clonado de p YD1 y su secuencia es
la siguiente.

5’
XXXCTCGAG(T)183’

donde X representa los tres nucleótidos que se
colocan delante de la secuencia de corte para Xho I para que la
enzima pueda cortar correctamente. En amarillo se puntualiza la
secuencia palíndrome de corte para Xho I.

A continuación, se coloca RNAasa H, la cual
realiza nicks en las cadenas del RNAm, dejando los extremos
3’OH libres que funcionarán de primers para la
segunda cadena que sintetizará la DNA polimerasa I
utilizando un kit second Strand synthesis(Fermentas). Luego, es
necesario ligar al cDNA doble cadena un adaptador con la
secuencia de corte para Acc65 (Operon Technologies). Esta
ligación se hace con la T4DNA ligasa.

La secuencia adaptadora que contiene el sitio de corte
para Acc65 es la siguiente

La secuencia en rojo es el sitio de corte para
Acc65.

El nucléotido A marcado en amarillo se agrega a
la secuencia de corte de Acc65 para lograr que el cDNA quede en
marco de lectura al ser
clonado.

Luego, pasamos a digerir el cDNA con la enzima de
restricción Acc65 y Xho I simultáneamente dado que
ambas son compatibles en su máxima actividad en un mismo
buffer de digestión (NEBuffer3). Así, obtenemos el
cDNA con los extremos cohesivos para dos enzimas de
restricción diferentes, listo para clonarlo en el vector p
YD1.

A continuación se presenta el sitio
múltiple de clonado de pYD1 a partir de cual se pudo
construir los oligonucleótidos necesarios para incorporar
las secuencias de restricción al cDNA ya en su
síntesis.

Figura2. Sitio múltiple de clonado
de p YD1. En círculos se encuentran marcados los sitios de
corte
para Acc65 y Xho I.

El cDNA sintetizado contiene las secuencias de corte
para la enzima Acc65 en el extremo 5’ de la cadena
codificante y la secuencia de corte para Xho I en el extremo
3’.

El vector utilizado en la construcción de la
biblioteca de cDNA para ser expresada en la superficie de
levaduras es el p YD1 ( yeast display vector, Invitrogen). El
vector pYD1 está específicamente diseñado
para direccionar y expresar proteínas recombinantes en la
superficie de Saccharomyces cerevisiae. Las
proteínas pueden ser analizadas por su habilidad para
interactuar con ligandos de interés,
como es en este caso EGFR.

Preparación del vector p YD1

A continuación se esquematizan los
componentes del vector utilizado para la construcción de
la biblioteca de cDNA.

Figura 3. Vector p YD1 con sus elementos. El
vector contiene un sitio múltiple de clonado
interrumpiendo el cassette AGA2. Este cassette contiene una
secuencia para aga2 seguido de una secuencia de corte para una
enterokinasa, luego un epitope Xpress, MCS, un epitope V5 y una
cola 6 His. Contiene un promotor inducible por galactosa (pgal1),
un origen de replicación de alto número de copias
en bacterias (pUC
ori), una resistencia a
ampicilina (ampicilin, codificante para la enzima
-lactamasa), un origen de replicación en levaduras
(CEN/ARS), un marcador de selección
para eucariotas (TRP1).

Dentro del cassette de aga2 se encuentra el sitio
múltiple de clonado, con sitios de corte únicos
para varias enzimas de restricción. La estrategia de
clonado para la construcción de la biblioteca de cDNA se
basa en el rol de las proteínas aga1 y aga2. Estas dos
proteínas están asociadas con el camino secretorio
en levaduras, de modo tal que aga 2 interactúa con aga1,
la cual está retenida en la pared celular de levaduras,
formando puentes disulfuro, quedando aga2 fuera del célula. Es
así como, de clonar el cDNA obtenido anteriormente como
proteína de fusión de
aga2 podremos direccionar las proteínas codificadas por el
cDNA a la superficie de las células de
levaduras.

El cassette que permite llevar a cabo esta estrategia
contiene flanqueando el MCS dos tags que codifican para epitopes
para poder
monitorear la expresión de las proteínas de
fusión. Estos epitopes son Xpress y V5. Finalmente,
también se encuentra una secuencia tag 6 His para
purificar, si se quisiera, la proteína de fusión.
De cualquier manera los tags río abajo del MCS no
serán expresados en la proteína de fusión,
ya que vamos a clonar un cDNA completo que contiene su sitio de
terminación de la traducción. Si el cDNA es ligado fuera de
fase con los tags río arriba del MCS, resultara en una
proteína abortiva por existir codones stop
prematuros.

La preparación del vector comienza con su
amplificación en bacterias electrocompetentes (ver
apéndice) para obtener mayor cantidad. Luego, se extrae
DNA plasmídico utilizando un HiSpeed Plasmid Midi Kit
Qiagen (Qiagen, Hilden, Alemania).

Una vez que se tiene cantidad suficiente del vector p
YD1, se procede a la digestión del mismo con las enzimas
correspondientes, Acc65 y XhoI (New England Biolabs). Dado que
las enzimas elegidas compatibilizan en su actividad
óptima, se podrá usar un buffer común a las
dos y así realizar una digestión simultánea.
Para ello se utiliza un buffer NET3 (ver apéndice). Ya
digerido el vector, se purifica con columna (QIAquick PCR
purification kit, Qiagen).

Luego, se procede a la ligación y posterior
transformación en bacterias (ver apéndice)
competentes 10G Supreme (Lucigen, Middleton,WI), mediante
electroporación, es decir un método
físico, de alta eficiencia. La
selección de las bacterias transformantes se realiza con
ampicilina y de todas las colonias, se eligen aproximadamente 30
colonias al azar para realizar un control de la
calidad y
diversidad de la biblioteca. Para ello se amplifica por colony
PCR utilizando un juego de
primers que flanquean el sitio de multiple clonado.

El producto de
PCR se corre un un gel de agarosa, y luego se manda a secuenciar.
Las secuencias así obtenidas se podrán comparar en
bases de datos
públicas, esperándose encontrar diferentes genes
trancripcionalmente activos en
células de carcinoma de cervix humano (Hela).

Si la calidad de la biblioteca es buena (pocos vectores
vacíos, diversidad de insertos), se procede a transformar
las levaduras. Primero se hace un pool de todos los clones de
E.coli (10G Supreme) que sobrevivieron la selección
por ampicilina. Se realiza una extracción de DNA
plasmídico usando un kit maxiprep Qiagen (Qiagen, Hilden,
Alemania) y, con el producto de la extracción, se
transforman las células de Saccharomyces cerevisiae
cepa EBY100 (Invitrogen).

Las transformantes son seleccionadas en medio SD-CAA (2%
de dextrosa, 0,67% de fuente de nitrógeno,0,5% de
hidrolizado de caseina ). Finalmente, las colonias de levaduras
sobrevivientes a la selección se agrupan y se colocan en
un cultivo líquido SD-CAA que además contiene 15%
de glicerol para ser guardadas ya alicuotadas a –80°C.
Esta será nuestra biblioteca de cDNA expresada en
levaduras.

2-Elección del fragmento de EGFR para hacer la
interacción.

El objetivo del
trabajo es
identificar proteínas citoplasmáticas con afinidad
por el receptor de EGF cuando el mismo se encuentra fosforilado.
Por lo tanto es razonable usar algún fragmento del EGFR
que se autofosforile en tirosina para hacer la
interacción. De trabajos en células de carcinoma
epitelial humano (línea celular A431)2 ,
sabemos que el receptor de EGF se autofosforila en tres tirosinas
del dominio
citoplasmático (Y1110, Y1172,
Y1197)3.

Estas tres tirosinas se encuentran en secuencias
similares a sitios de fosforilación para tirosinas
descriptos previamente. Sin embargo se sabe que la tirosina Y1197
es la más fuertemente fosforilada in vivo ante la
inducción por EGF, lo que la hace una buena
candidata para la interacción. Por lo tanto vamos a usar
un péptido de 15 aminoácidos centrado en Y1197, es
decir de 1165-1180.

1 mrpsgtagaa llallaalcp asraleekkv cqgtsnkltq lgtfedhfls
lqrmfnncev

61 vlgnleityv qrnydlsflk tiqevagyvl ialntverip
lenlqiirgn myyensyala

121 vlsnydankt glkelpmrnl qeilhgavrf snnpalcnve
siqwrdivss dflsnmsmdf

181 qnhlgscqkc dpscpngscw gageencqkl tkiicaqqcs
grcrgkspsd cchnqcaagc

241 tgpresdclv crkfrdeatc kdtcpplmly npttyqmdvn
pegkysfgat cvkkcprnyv

301 vtdhgscvra cgadsyemee dgvrkckkce gpcrkvcngi
gigefkdsls inatnikhfk

361 nctsisgdlh ilpvafrgds fthtppldpq eldilktvke
itgflliqaw penrtdlhaf

421 enleiirgrt kqhgqfslav vslnitslgl rslkeisdgd
viisgnknlc yantinwkkl

481 fgtsgqktki isnrgensck atgqvchalc spegcwgpep
rdcvscrnvs rgrecvdkcn

541 llegeprefv enseciqchp eclpqamnit ctgrgpdnci
qcahyidgph cvktcpagvm

601 genntlvwky adaghvchlc hpnctygctg pglegcptng
pkipsiatgm vgalllllvv

661 algiglfmrr rhivrkrtlr rllqerelve pltpsgeapn
qallrilket efkkikvlgs

721 gafgtvykgl wipegekvki pvaikelrea tspkankeil
deayvmasvd nphvcrllgi

781 cltstvqlit qlmpfgclld yvrehkdnig sqyllnwcvq
iakgmnyled rrlvhrdlaa

841 rnvlvktpqh vkitdfglak llgaeekeyh aeggkvpikw
malesilhri ythqsdvwsy

901 gvtvwelmtf gskpydgipa seissilekg erlpqppict
idvymimvkc wmidadsrpk

961 freliiefsk mardpqrylv iqgdermhlp sptdsnfyra
lmdeedmddv vdadeylipq

1021 qgffsspsts rtpllsslsa tsnnstvaci drnglqscpi
kedsflqrys sdptgalted

1081 siddtflpvp eyinqsvpkr pagsvqnpvy hnqplnpaps
rdphyqdphs tavgnpeyln

1141 tvqptcvnst fdspahwaqk gshqisldnp
dyqqdffpke
akpngifkgs taenaeylrv

1201 apqssefiga

Figura 4. Secuencia de aminoácidos del receptor
de EGF. Las tirosinas atuofosfotiladas están marcadas en
rojo, y las secuencia elegida en azul.

La secuencia peptídica elegida será
entonces STAENAEYLRVAPQS.

3-Selección de clones positivos por
citometría de flujo.

El screening se realizará por citometría
de flujo (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting).

Para ello se crecen las células de la biblioteca
en medio SD-CAA hasta una absorbancia a 600nm de aproximadamente
5. Luego se pasan a un medio SRG-CAA (SD-CAA + 2% Galactosa) a
una densidad óptica
inicial de 0.5 y se incuba over night a 30ºC. Este medio
induce la expresión del cassete de AGA2 con el inserto
(proteína de fusión), ya que el mismo se encuentra
bajo el promotor de GAL1, inducible por galactosa.

Una vez inducidas las células se centrifugan y
lavan dos veces con PBS (Phosphate buffer saline).
Luego se incuban en un volumen de
500μL de PBS con 10μM del pιptido elegido
fosforilado y biotinilado por 4 horas a 4ºC.

Pasado este tiempo, se
agrega hasta una concentración de 40μM el
péptido sin fosforilar ni biotinilar para eliminar por
competencia las
interacciones no especificas entre el péptido marcado y
las proteínas de la superficie celular. Las células
que expresen en superficie alguna proteína que
interactúe específicamente con el péptido
fosforilado, quedaran marcadas con biotina. Luego de lavar dos
veces con PBS, se incuban las células con 1:500 de
streptavidina conjugada a ficoeritrina (SA-PE,
Streptavidine-Phycoerythrin, Invitrogen). Tras 20 minutos a
4ºC de incubación se lavan dos veces las levaduras
con PBS.

La citometría de flujo se realiza en un equipo
comercial (FACSaria, BD Bioscience) excitando a 488nm y midiendo
la emisión a alrededor del máximo a 570nm (con un
filtro pasa banda de 585±22 nm). El espectro de
fluorescencia de la ficoeritrina se muestra en el
apéndice. Para calibrar la citometría primero se
analizan levaduras EBY100 sin transformar, incubadas con el
péptido y SA-PE como se detalló anteriormente, para
definir el umbral de fluorescencia que será utilizado para
seleccionar las células de la biblioteca. Se espera
obtener un gráfico como el de la figura 5, en el cual se
muestra la región supraumbral definida para la
selección.

Figura 5. Distribución esperada para la
calibración de la citometría de flujo. PE:niveles
de flurescencia de la ficoeritrina (a 585nm). APC: niveles de
fluorescencia de la aloficocianina (a 670nm). P2: Región
de selección.

Las células de la biblioteca seleccionadas por el
citómetro se recolectan en una placa con medio SD-CAA.
Para aumentar la especificidad del screening se pueden hacer
varias rondas del procedimiento
descrito, usando las células seleccionadas como punto de
partida para la siguiente ronda. Además se puede alternar
el uso de SA-PE con SA-APC (streptavidine-allophycocyanin,
estreptavidina conjugada a aloficocianina), para minimizar la
selección de clones que unen directamente los reactivos de
detección (ficoeritrina o aloficocianina). La
detección de APC se realiza excitando a 633nm y midiendo
la fluorescencia alrededor de 670nm. El espectro de la
aloficocianina se muestra en el apéndice. Por este
método de screening se pueden seleccionar los clones que
expresen en superficie alguna proteína que
interactúa específicamente con el péptido
fosforilado.

Una vez identificados estos clones se minipreparan los
plásmidos de cada uno utilizando un kit QIAprep Spin
Miniprep (Qiagen, Hilden, Alemania) y se transforman en bacterias
electrocompetentes (Ver apéndice). Una vez seleccionadas
en medio con ampicilina, se puede hacer una colony PCR con los
primers pYD1 For y Rev (detallados anteriormente), y secuenciar
el producto de PCR. Conociendo la secuencia se puede llevar acabo
una búsqueda (utilizando BLAST) en bases de datos
públicas, e identificar el cDNA aislado. De esta manera es
posible saber la identidad de
las proteínas que interactúan
específicamente con el péptido
fosforilado.

4-Subclonado en vector de
expresión.

Como verificación de la interacción entre
la proteína encontrada y el fragmento fosforilado de EGFR,
se hará un ensayo de
co-inmunoprecipitación de células HeLa. Para ello
es necesario subclonar el cDNA de la proteína hallado por
el screening en un vector de expresión para eucariota
superior. Consideraremos que una de las proteínas que
interactúan con el dominio fosforilado del EGFR es la
subunidad regulatoria de la quinasa PIP3 humana. Para llevar a
cabo este subclonado, será necesario buscar la secuencia
completa de cDNA de la subunidad de dicha proteína y
diseñar los primers adecuados para levantar la secuencia
de cDNA de interés. Se utilizará para este fin el
vector pCMV-script (Stratagene) detallado en la figura
6.

Figura 6. Vector pCMV-Script. MCS: Sitio de
Múltiple Clonado. SV40 pA: Sito de corte y
poliadenilación tardío. F1 Ori: Origen de
replicación de fago filamentoso. P bla/P SV40: Promotores
procariota/eucariota para gen de resistencia a antibiótico
neo/kan. TK pA: Sitio de corte y poliadenilación. pUC Ori.
Origen de replicación para E.Coli. P CMV: Promotor de
citomegalo virus, fuerte
constitutivo y eucariota.

En primer lugar se amplifica el vector pCMV-Script en
bacterias y miniprepara siguiendo los pasos utilizados en el
vector pYD1. Luego se digiere con HindIII y XhoI. Ya que estas
enzimas son parcialmente compatibles en el buffer NEB 3 de New
England Biolabs a 37ºC (100% actividad HindII, 75-100%
actividad XhoI) se pueden incubar ambas enzimas juntas. Luego de
la digestión se purifica el vector cortado con una columna
de purificación QIAquick PCR purification Kit
(Qiagen).

Figura 7. Sitio de múltiple
clonado del vector pCMV-Script

Por otro lado se miniprepara el plásmido, de las
bacterias transformadas, que provenía de las levaduras que
interactuaban con el fragmento peptídico de EGFR
fosforilado (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen). En este caso,
consideramos que tenemos una cultivo de células Hela que
está expresando activamente la subunidad regulatoria del
PIP3 quinasa.. Es sabido que esta subunidad de la quinasa PIP3
interactúa con la región fosforilada del receptor
EGF. Procedemos ahora a extraer mRNA del mismo modo que fue
realizado en el apartado 1. Una vez tenido el mRNA intacto y
total de estas células, continuamos con una
reacción de retrotranscrición con M-MulV
(Fermentas) utilizando como primer una secuencia de oligodT-XhoI
(Operon Technologies) y una secuencia primer que contiene un
segmento que aparea con el extremo 5’ del gen y que lleva a
su vez la secuencia de corte para Hind III. Primero se realiza la
síntesis de la primera cadena de DNA de la secuencia de
interés y luego, llevamos todo el producto de
reacción a una PCR para amplificar el cDNA de PIP3 qinasa.
Se corre el producto de la digestión en un gel de agarosa
0.8%, teñido con Bromuro de Etidio y se aísla la
banda correspondiente al cDNA cuyo tamaño molecular
aproximadamente 5kb.Luego se purifica el DNA utilizando QIAquick
Gel Extraction Kit (Qiagen).

La reacción de PCR que nos permita levantar ese
fragmento de cDNA de la subunidad regulatoria de PIP3 quinasa se
lleva a cabo con primers que diseñamos sobre la base de la
secuencia de cDNA encontrada en las bases de datos (PUB
MED).

A continuación, se muestra el diseño
de los primers específicos que contienen las secuencias de
corte para las dos enzimas de restricción que serán
usadas: HindIII y XhoI.

Primers diseñados para aislar el cDNA de la
subunidad regulatoria de la PIP3 quinasa humana.

Primer FORWARD (23 nucleótidos)

5’ XXXAAGCTTAATGGCTGGAGTCC 3’ Temperatura de
melting = 60°C

%GC= 43%

La bese en rojo deja ver el nucleótido extra
agregado al primer forward para lograr que la secuencia
codificante quede en marco de lectura al ser clonada.

Primer REVERSE (25 nucleótidos)

5’ XXXCTCGAGTTACTTTATTGCAATG 3’ Temperatura
de melting = 60°C

%GC= 35 %

Ya teniendo los primers diseñados, haremos la
reacción de PCR, tomando como molde el DNA del vector
linealizado p YD1.

El programa de PCR y
las concentraciones de todos los componentes necesarios en la
reacción se detallan a continuación.

Tabla 1. Protocolo de PCR
llevado a cabo en la amplificación del fragmento a
clonar.

Programa de PCR

Tabla 2. Programa de
PCR llevado a cabo para la amplificación del fragmento a
clonar.

Una vez realizada la reacción de PCR, tenemos en
cantidad suficiente el fragmento de interés que contiene
el cDNA de la subunidad regulatoria de la PIP3 quinasa que ya
tiene incorporados los sitios de corte para las enzimas Hind III
y XhoI.

Ahora, debemos proceder a correr el fragmento de PCR en
un gel de agarosa 0,8% para su visualización por
tinción con BrEt. Luego, logramos extraer la banda del
peso molecular de interés y purificamos el DNA utilizando
un kit para tal fin(QIAquick Gel Extraction Kit,
Qiagen).

Una vez purificado debidamente, el cDNA debe ser
digerido con las enzimas HindIII y XhoI siguiendo el siguiente
protocolo.

Protocolo de digestión.

Buffer 10X de restricción 10l

Enzima Hind III 1l (1U/g
DNA)

Enzima XhoI 1l(1U/g
DNA)

cDNA 0,1 g DNA por l

Agua hasta 20 l finales

La reacción transcurre por dos horas a
37°C.

El mismo protocolo es seguido para la digestión
del vector pCMV-Script, una vez que éste ha sido
minipreparado (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen).

Una vez que el vector fue cortado, éste es
corrido en un gel de agarosa 0,8% y luego, seleccionada la banda
que contiene le vector linealizado, se procede a
purificarla(QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen).

Procedemos luego a la reacción de ligación
cuyo protocolo se muestra a continuación.

Buffer de ligación 5X
4l

Vector (4,3kb) 20ng

Inserto (5 kb) 3:1 60ng

T4 DNA ligasa 0,5 l

Volumen final 20l

Se incuba la reacción a 37°C durante 1
hora.

El producto de ligación se utiliza para
transformar en bacterias electrocompetentes de la misma manera
que se realizó para el vector pYD1. Una vez seleccionadas
las bacterias en medio con kanamicina, se vuelve a minipreparar
el vector de varias colonias para realizar el screening por
colony PCR, utilizando los primers universales T3 y T7 que
amplifican el sitio múltiple de clonado y darán
cuenta de qué colonias tienen el vector
recombinante.

El producto de PCR en cada caso se corre es un gel de
agarosa 0,8% y se tiñe con BrEt. Así se seleccionan
qué colonias tienen el vector deseado. Realizado este
paso, volvemos a la/s colonias que contiene el vector
recombinante y realizamos una minipreparación de DNA
plasmídico con el kit para ese fin (QIAprep Spin Miniprep
Kit).

5-Ensayo de
co-inmunoprecipitación.

Para realizar el ensayo de
inmunoprecipitación hay que hacer una
cotransfección transiente del vector pCMV-Script, junto
con un vector de expresión que contenga el cDNA de EGFR
(considerando que ya esta clonado).

El ensayo se hará en células HeLa, pero se
puede hacer en cualquier línea de células de
mamíferos. Se transfectan las
células por electroporación (ver protocolo en
apéndice), buscándose altos porcentajes de
células transfectadas, y se incuban por unas horas para
asegurase de que expresen las proteínas. En la
inmunoprecipitación se usará un anticuerpo
monoclonal de ratón contra el epítope Xpress no
conjugado (Invitrogen).

En primer lugar se hace un lisado de las células,
extrayendo la fracción citoplasmática, utilizando
un protocolo optimizado para no desarmar las interacciones entre
proteínas (ver apéndice). Utilizaremos un kit
(Actvie Motif Co-IP) para
llevar acabo la inmuprecipitación, cuyo protocolo se
especifica en el apéndice. El fundamento del método
es la inmovilización de los anticuerpos (contra el
epítope Xpress) en un sustrato de fácil
precipitación, recubiertas de proteína A y G, que
se unen a la región constante de los anticuerpos. Luego se
incuban estas perlas (con el anticuerpo asociado) con el extracto
celular. La proteína clonada en el vector pCMV-Script
contiene el epítope Xpress, por lo que se unirá a
las perlas. Si efectivamente interacciona con el receptor de EGF,
debería formarse una cadena de interacciones, a saber;
proteína A (o G) – Anticuerpo contra Xpress –
epítope Xpress fusionado a proteína que
interacciona con EGFR – EGFR.

Todo este complejo ha de precipitar junto con las perlas
cuando se centrifugue. Para identificar las proteínas
precipitadas se podrá hacer un western blot (ver protocolo
en apéndice), utilizando un anticuerpo contra EGFR
fosforilado en Y1197. Como controles se podrán usar
anticuerpos para EGFR sin fosforilar (es decir que no diferencia
si esta o no fosforilado en Y1197) lo cual verifica que la
interacción entre la proteína encontrada por el
screening y EGFR efectivamente se da por la región
correspondiente al péptido seleccionado
fosforilado.

Además se puede hacer un control con anticuerpo
contra Xpress para verificar que la proteína encontrada
este precipitando bien.

Todo el procedimiento experimental descrito resulta en
la identificación de proteínas
citoplasmáticas de células humanas que
interaccionan con un dominio fosforilado del receptor
EGFR.

Conclusión

Mediante los protocolos y
procedimientos
descriptos en el trabajo,
diseñamos una estrategia para generar una biblioteca de
levaduras que expresan en superficie las proteínas
correspondientes a los cDNAs aislados de células de
carcinoma de cervix humano (HeLa). Luego identificamos por medio
de selección por citometría de flujo las levaduras
que, gracias a la proteína recombinante que
poseían, eran capaces de unir un péptido
correspondiente a una región de autofosforilación
del receptor de factor de crecimiento epitelial (EGFR). Esto
corresponde a un screening de la biblioteca, ya que se
identifican los clones individuales que estamos buscando. Para
verificar la interacción hallada, desarrollamos un ensayo
de co-inmunoprecipitación, para lo cual fue necesario
subclonar el cDNA de las células HeLa en vectores de
expresión.

El método de "yeast display" utilizado tiene la
ventaja de expresar las proteína en levaduras, lo que
permite algunas modificaciones postraduccionales. Sin embargo al
ser una proteína de fusión, y al secretarse la
proteína al exterior es posible que no tengan sus
conformaciones nativas y no puedan interaccionar normalmente. Por
lo tanto el ensayo, aunque permite encontrar interacciones, no es
exhaustivo y debería ser usado para generar hipótesis que luego serán
verificadas por otros métodos.
En este caso usamos coinmunoprecipitación.

Referencias

1. Bidlingmaier, S. Liu, B. Construction and
Apllication of a Yeast Surface-displayed Human cDNA library to
identify post-translational modification-dependent
protein-protein interactions. Molecular and Cellular
proteomics, 533-540, 2007.

2. Downward J., Parker P., Waterfield M.D.
Autophosphorylation sites on the epidermal growth factor
receptor. Nature 311, 483-485 (1984).

3. Ullrich,A., Coussens,L., Hayflick,J.S., Dull,T.J.,
Gray,A., Tam,A.W., Lee,J., Yarden,Y., Libermann,T.A.,
Schlessinger,J.,Downward,J., Mayes,E.L.V., Whittle,N.,
Waterfield,M.D. and Seeburg,P.H.. Human epidermal growth
factor receptor cDNA sequence and aberrant expression of the
amplified gene in A431 epidermoid carcinoma cell.
Nature 309 (5967), 418-425 (1984).

Sitios visitados

-www.neb.com (New England Biolabs)

-www.invitrogen.com

-www.fermentas.com

-www.promega.com

-www.bdbiosciences.com/spectra.

– www.ncbi.nlm.nih.gov

Alan Bush y Laila Toum –