Camino de señalización de EGFR

2. Objetivo
3. Construcción de
   biblioteca de cDNA en humanos
4. Elección del
   fragmento de EGFR para hacer la
   interacción
5. Selección de
   clones positivos por citometría de
   flujo
6. Subclonado
   en vector de expresión
7. Ensayo de
   co-inmunoprecipitación
8. Conclusión
9. Referencias

Identificación de los
componentes en el camino de señalización de EGFR
mediante la construcción de una biblioteca de
cDNA humana
expresada en la superficie de células de
levaduras (técnica de yeast display)

Introducción

Si bien las modificaciones post-traduccionales como la
fosforilación, acetilación, glicosilación,
agregado de grupos sulfato,
entre otras, son de superlativa importancia en la
regulación fina de infinidad de procesos
biológicos dentro la célula,
no es de menor tenor el papel desempeñado por la interacción de algunas proteínas
con una o más de estas modificaciones.

Es, precisamente, para estudiar este tipo de
interacciones que hoy no poseemos de una variedad amplia de
técnicas que nos permita abordar con
precisión este problema. Hasta el momento, entre las
técnicas más utilizadas para identificar a gran
escala
proteínas o fragmentos de las mismas con propiedades
específicas de unión encontramos al sistema del
doble híbrido y al llamado phage display. No
obstante, estos sistemas poseen
varias limitaciones.

Por empezar, el método del
doble híbrido no nos permite identificar
proteínas que se unan a proteínas que se encuentren
fuera de la célula o
compuestos sintetizados externamente. En relación al
phage display, su mayor inconveniente es la incapacidad
que poseen los sistemas procariotas de llevar a cabo
modificaciones post-traduccionales de proteínas
eucariotas, lo que puede traer aparejado su falta de actividad
biológica1.

En virtud de sortear estas dificultades que presentan
estas metodologías en relación a nuestro estudio de
interacción de algunas proteínas con las
modificaciones post-traduccionales de otras, nos propusimos
construir una biblioteca de cDNA en humanos expresada en la
superficie de las células de Saccharomyces
cerevisiae, estrategia
llamada yeast display. Dado que los caminos de
expresión de proteínas en levaduras son similares a
aquellos encontrados en células de mamíferos, nos permitimos pensar que las
proteínas humanas o fragmentos de las mismas expresadas en
la superficie de células de levadura serán
plegadas, modificadas post-traduccionalmente de modo correcto y,
por tanto, serán funcionales.

Por todo lo antes expuesto, la estrategia de
construcción de una biblioteca de cDNA en humanos
expresada en la superficie de las células de levaduras
comienza a ofrecerse como una metodología poderosa por las posibilidades
que ofrece y sus múltiples aplicaciones entre las cuales
encontramos la detección de proteínas que
interactúen con drogas
así como también la selección
de ciertas proteínas con novedosas actividades
enzimáticas.

Objetivo

En el presente trabajo nos
proponemos identificar los componentes del camino de
señalización del receptor del factor de crecimiento
epidérmico (EGFR) que tienen afinidad por las tirosinas
fosforiladas del mismo utilizando la técnica de yeast
display.