Efecto de un surfactante sobre la integridad de espermatozoides ovinos crioconservados (página 2)

Cuadro 1.
Indice de motilidad (IM) y porcentaje de acrosomas normales (AN)
de semen ovino descongelado, procesado comparativamente
con diluyentes tris y citrato de Na, ambos con (+) y sin (-)
adición de surfactante (1er. ensayo: n =
29).
Motility index (IM) and normal acrosome-rate (AN) in
frozen-thawed ram semen
extended comparatively in tris and Na-citrate extenders,
both with (+) and without (-) surfactant (1 st trial: n =
29).

En filas: a¹b (p£ 0.05).
En columnas: c¹d (p£0.05).

El diseño
que se siguió en los cuatro ensayos fue el
siguiente:

1er. ensayo. Se fraccionaron 29 eyaculados, que,
siguiendo un diseño factorial 2 x 2, se diluyeron
paralelamente en diluyentes tris (Solución madre:
tris-[hidroximetil]aminometano 3.29% p/v, ác.
cítrico 1.85% p/v, fructosa 1.36% p/v, 335 mOsm, pH 6.8) y
diluyentes citrato de Na (Solución madre: citrato de Na
2H2O 2.9% p/v, ácido cítrico. H2O 0.03% p/v, 270
mOsm, pH 6.7), sin y con 0.5% (v/v) Equex STM®2.
La dilución se realizó en forma rápida,
incorporando a las fracciones de semen la totalidad del
respectivo diluyente en aproximadamente 3 segundos.

2º ensayo. Se fraccionaron 10 eyaculados de
acuerdo a un diseño factorial 3 x 2, utilizando, como en
el primer ensayo, los diluyentes tris y citrato de Na, pero
agregando como tercer diluyente una variante del diluyente de
citrato de Na con sulfanilamida (citrato de Na 2H2O 2.9% p/v,
ácido cítrico H2O 0.03% p/v, sulfanilamida 0.3%
p/v, 280 mOsm, pH 7.6) descrito por Eibl (1978). Los tres
diluyentes se utilizaron sin y con 0.5% v/v de surfactante,
respectivamente, y, a semejanza del primer ensayo, se
incorporaron en aproximadamente 3 segundos a las fracciones de
semen.

3er. ensayo. Se fraccionaron 12 eyaculados que se
diluyeron respectivamente en diluyente citrato de Na (2.9%) con
sulfanilamida y una variante del mismo diluyente con 3.1% de
citrato de Na (citrato de Na 2H2O 3.1% p/v, ácido
cítrico H2O 0.03% p/v, sulfanilamida 0.3% p/v, 335 mOsm,
pH 7.6). De acuerdo a un diseño factorial 2x2x2, ambas
formulaciones de diluyentes se utilizaron sin y con surfactante
(0.5% v/v), sometiendo a todas las fracciones a una
dilución rápida por un tiempo
aproximado de 3 segundos y dilución lenta,
respectivamente, la cual se extendió por períodos
de 5 a 10 min.

4º ensayo. Se fraccionaron 10 eyaculados,
que, conforme a un diseño factorial 2×2, se procesaron en
diluyente tris (utilizado en los ensayos 1 y 2), sin y con 0.5%
v/v surfactante, comparando una dilución rápida con
una lenta, de acuerdo a lo descrito en el ensayo
anterior. Se sometió el efecto de los tratamientos sobre
IM y AN a análisis de varianza y test de Duncan,
complementado con test de "t" (TWOSAM), asumiendo Ho con p0.05.
Se utilizó el paquete estadístico STATGRAF
5.1.

RESULTADOS

Los parámetros evaluados de motilidad e
integridad de acrosomas en la comparación de los
diluyentes tris vs. citrato de Na del 1er. ensayo se presentan en
el cuadro 1.

En el cuadro 1 se observa que el índice de
motilidad es significativamente inferior en las fracciones
diluidas con citrato de Na, y en especial en la de citrato de Na
sin surfactante. En 22 de las 29 muestras (75.9%) que
constituyeron esta fracción, se registró alta
proporción de flagelos espermáticos inflectados, no
observados en la fracción con surfactante, ni tampoco en
las fracciones procesadas en diluyente tris.

El efecto de las formulaciones de tris vs. citrato de Na
no es significativo sobre la integridad de los acrosomas, pero,
en cambio, es
significativa en ambos diluyentes la diferencia atribuible al
surfactante.

Los resultados del 2º ensayo, en el cual se
agregó a las dos formulaciones del 1er. ensayo una
variante del diluyente citrato de Na con sulfanilamida,
están representados en el cuadro 2.

En el cuadro 2 se observa que IM en ambas fracciones con
diluyentes citrato de Na sin surfactante es significativamente
menor, como consecuencia de numerosas inflexiones de flagelo de
las células
espermáticas, registradas ya tras la dilución en
todas las muestras de dichas fracciones. La alteración no
se observó en las fracciones con surfactante. El
porcentaje de acrosomas normales es significativamente mayor en
las fracciones procesadas en diluyente de citrato de Na con
surfactante, tendencia que no fue significativa en el diluyente
tris.

Los resultados del 3er. ensayo, destinado a comprobar
posibles efectos de la rapidez de dilución, como
también de la osmolaridad de diluyentes de citrato de Na,
se desprenden del cuadro 3.

Cuadro 2.
Indice de motilidad (IM) y porcentaje de acrosomas normales (AN)
registrados en fracciones de semen ovino descongeladas
después de su procesamiento en diluyentes tris, citrato de
Na y citrato de Na-sulfanilamida, todas comparativamente sin (-)
y con (+) surfactante (2° ensayo; n=10).
Motility index (IM) and normal acrosomes (AN) of split
frozen-thawed ram semen extended with tris, Na-citrate and
Na-citrate-sulphanilamide,
comparatively with (+) and without (-) surfactant (2nd trial;
n=10).

En filas: a¹b (p£0.05).
En columnas: c¹d (p£ 0.05).

Cuadro 3.
Indice de motilidad (IM) y porcentaje de acrosomas normales (AN)
registrados en fracciones de semen ovino descongelado,
sometido comparativamente a dilución rápida (R) vs.
lenta (L) en dos niveles de citrato de Na (2.9% vs. 3.1%), sin
(-) y con (+) surfactante (3er. ensayo; n=12).
Motility index (IM) and normal acrosomes (AN) of frozen-thawed
ram semen split samples extended comparatively fast (R) vs. slow
(L)
in two levels of Na-citrate extender (2.9% vs. 3.1%), with (+)
and without (-) surfactant. (3rd trial; n=12).

a¹b (p£0.05).

Cuadro 4.
Indice de motilidad (IM) y proporción de acrosomas
normales (AN) registrados en fracciones de semen ovino
descongelado,
diluido comparativamente en forma rápida (R) y lenta (L)
en tris sin (-) y con (+) surfactante (4º ensayo: n=10).
Motility index (IM) and normal acrosomes (AN) in split samples of
frozen-thawed ram semen after comparatively rapid (R) vs. slow
(L) dilution in tris-extender,
without (-) and with (+) surfactant (4th trial: n=10).

a¹b (p£0.05)

Del cuadro 3 se desprende que IM y AN no difieren por
efecto de la concentración del citrato de Na. Las
diferencias atribuibles a la velocidad de
dilución no son significativas, aun considerando la
muestra en su
conjunto. En cambio es significativo el efecto del surfactante
sobre AN, como también sobre IM al establecer la
comparación por bloques. No se observaron interacciones
entre las variables
computadas (p>0.05).

Los resultados obtenidos en el 4º ensayo,
diseñado para comprobar un posible efecto de la velocidad
de dilución sobre los parámetros IM y AN, al
utilizar diluyente tris se reflejan en el cuadro 4.

Las diferencias atribuibles al efecto del surfactante
sobre la integridad de los acrosomas son significativas. No son
significativas las diferencias atribuibles a la velocidad de
dilución. No se observó interacción (p>0.05) entre las variables
computadas.

DISCUSIÓN

En la comparación de ambas formulaciones, tris
vs. citrato de Na (cuadro 1) es destacable, en primer lugar, el
efecto protector del surfactante sobre la integridad de los
acrosomas, tanto en tris como en citrato de Na. Pero no menos
interesante fue el efecto de la presencia o ausencia del
surfactante sobre la motilidad de las fracciones procesadas con
diluyente citrato de Na. En este diluyente, sin surfactante, se
observaron proporciones altas de espermatozoides con flagelos
inflectados, como indicación de un shock osmótico.
Esta alteración secundaria de los espermatozoides, que
probablemente pasó desapercibida y no se registró
en los primeros exámenes, se atribuyó inicialmente
a una falla del diluyente respectivo. Sin embargo, en el
transcurso del ensayo, con nuevas partidas de diluyente sin
surfactante, la misma alteración se observó en
forma constante, inmediatamente tras la dilución, lo que
no se observó en las fracciones adicionadas del
surfactante.

Los ensayos 2º y 3º se diseñaron como
consecuencia de las alteraciones morfológicas observadas
en el ensayo 1º. Aumentada la osmolaridad del diluyente,
tanto por la adición de sulfanilamida (ensayo 2º,
cuadro 2) como por una mayor concentración de citrato de
Na a 3.1% (ensayo 3º, cuadro 3), los resultados fueron
similares: de motilidad baja en comparación a las
fracciones con surfactante, ligada a las inflexiones de flagelo
descritas. La dilución comparativamente lenta, incluida en
el ensayo 3º, mostró una tendencia a menores
inflexiones flagelares y mejor motilidad, sin que esta
última fuera estadísticamente
significativa.

En el ensayo 4º (cuadro 4), en que se
comparó el efecto de una dilución rápida con
una dilución lenta de semen en tris, los valores de
AN fueron similares y las diferencias de los valores de IM
no fueron significativas. Se corroboró, nuevamente, el
efecto protector del surfactante sobre la integridad
morfológica de acrosomas y una tendencia a elevar la
motilidad, significativa al considerar la muestra en
conjunto.

El efecto de algunos surfactantes o tensidos sobre las
membranas de las células espermáticas aparece
ligado a la constitución del diluyente, particularmente
a la presencia de lecitina aportada por la yema de huevo. Mann
(1964) ya describe que Na dodecil-sulfato (SDS), componente del
tensido por nosotros utilizado, causa la completa
inhibición de la fructolisis y abolición de la
motilidad del semen ovino en concentraciones de 0.0015 M (0.043%
p/v). En semen porcino, Pursel y col. (1978) observaron un efecto
protector del OEP al 1-1.5% en diluyente Beltsville F5 (BF5) con
20% de yema de huevo, pero un efecto deletéreo de OEP al
0.1% sobre motilidad e integridad de acrosomas de semen incubado
por 1 h en diluyente sin yema de huevo. Tales resultados
reforzaron la hipótesis sustentada por Graham y col.
(1971), de que OEP ejercería su acción
beneficiosa, más bien a través de la
alteración de los constituyentes de la yema de huevo que
por un efecto directo sobre las membranas celulares.

Los estudios de Quinn y col. (1980) sobre la
susceptibilidad de las células espermáticas al
shock térmico -atribuido primariamente a ruptura
irreversible de las membranas con pérdida de los
constituyentes intracelulares- demostraron que el efecto
protector de la fosfatidilcolina exógena se debe a una
interacción reversible de las estructuras
lipídicas con los fosfolípidos de las membranas
espermáticas. En sus experimentos con
espermatozoides lavados, la protección al shock
térmico fue inmediata por la adición 0.5 o 1 mg/ml
de fosfatidilcolina, pero la susceptibilidad al shock
aumentó después de 3 horas de incubación a
37°C, independientemente de la concentración del
fosfolípido. Es más, dichos autores concluyeron que
la presencia de concentraciones mayores de fosfolípidos
exógenos pueden ser lesivas debido a la
transformación del lípido con formación de
lisofosfátidos y otros productos de
degradación.

El mecanismo bioquímico por el cual el detergente
produce la estabilización de la membrana
espermática en presencia de la fosfatidilcolina aportada
por la yema de huevo no está claramente dilucidado. Menos
aún lo está el efecto de dicha
estabilización de las membranas. Por una parte
podría suponerse que la aparente estabilización de
las membranas, apreciable a través del examen
microscópico, pudiera deberse a una mayor
permeabilización de ellas. Haciéndola más
permeable a los solutos, a través de microporos, se
evitaría una ruptura mayor, a consecuencia de los
desequilibrios osmóticos durante la dilución y
congelación/des-congelación de las células.
De una mayor permeabilidad de la membrana debiera esperarse
también una posible pérdida de los constituyentes
intracelulares. Pero, por otra parte, podría suponerse que
una estabilización artificial de la estructura
membranosa pudiera interferir en la capacidad de reacción
acrosomal, necesaria para el proceso de
penetración espermática al ovocito. En contra de
ambas suposiciones está el hecho de que, desde los ensayos
de Graham y col. (1971), OEP viene utilizándose por
más de 20 años en la crioconservación de
semen porcino y por un período algo menor en
crioconservación de semen equino (Martin y col., 1978;
Cochran y col., 1984), si bien la fertilidad obtenida en esas
especies, aun utilizando cantidades comparativamente altas de
células espermáticas por dosis inseminada, no
alcanza a la del semen no congelado. En un reciente ensayo de
inseminación con semen fresco, aplicado en ovejas el
día de la colección, tras utilizar como diluyente
tris-yema-glicerina con 0.5% de Equex STM, Martínez
(1996)* obtuvo 66.7% de preñez. Con semen bovino,
congelado comparativamente en tris, con y sin el mismo tensido,
Mercado (1996)
obtuvo resultados de penetración espermática de
ovocitos in vitro de 75.4% y 73.4%, respectivamente, los que no
difieren significativamente entre ellos.

Es probable que el efecto protector del tensido
utilizado sobre la integridad espermática en semen ovino
no conduzca per se a elevar la fertilidad del semen aplicado por
la vía cervical. El mayor obstáculo para una
aplicación cervical profunda o una siembra del semen en el
lumen uterino lo seguirá constituyendo la estructura del
cervix (Kristinson y Wissdorf, 1985; Reinhold y col., 1987;
Halbert y col., 1990a). Las técnicas
de inseminación transcervical, descritas por Andersen y
col. (1973), Halbert y col. (1990b y 1990c), requieren de
destrezas especiales, son estresantes y no se logran en todas las
hembras, lo cual mantiene limitada su difusión a terreno.
En opinión de Salamon y Maxwell (1995b), en la actualidad
sólo la inseminación laparoscópica ofrece
índices de fertilidad satisfactorios y repetibles,
permitiendo una reducción sustancial del número de
espermatozoides mótiles inseminados.

Independientemente del destino que se dé al semen
ovino crioconservado, estimamos que la adición del tensido
al semen procesado en tris permite aumentar en cerca de 60% los
espermatozoides aparentemente intactos, en comparación al
diluyente sin el aditivo. Una reducción de la gran
cantidad de espermatozoides congelados por dosis contribuye a una
mejor sobrevivencia de ellos (Sánchez, 1994), por la menor
cantidad de células que comparten las fracciones fluidas
remanentes durante la cristalización (Amann y Pickett,
1987; Parks y Graham, 1992).

RESUMEN

Con el objetivo de
comprobar el efecto de la adición de un tensido comercial
(Equex STM® a diluyentes tris y citrato de Na en la
sobrevivencia de semen ovino, se realizaron 4 ensayos con
diseño factorial de crioconservación de eyaculados
de 2 carneros de raza Austral y un carnero Border Leicester,
procesados separadamente. Fue común para todos los ensayos
la dilución monofásica rápida a temperatura
ambiente, en
diluyentes con 20% (v/v) de yema de huevo, divididos en
fracciones sin y con 0.5% (v/v) de Equex STM, el empaque en
minitubos de 0.25 ml, períodos de adaptación a
+5°C de 3 a 4 h, la curva de congelación en vapor de
nitrógeno a 10 cm sobre la fase líquida de
aproximadamente 5°C/min y la posterior descongelación
en agua a
40°C por 15 s. Los criterios de evaluación
del semen descongelado fueron el índice de motilidad (IM)
y la integridad del borde apical de los acrosomas (AN). Los
resultados se sometieron a análisis de varianza, test de
Duncan y test de "t" (TWOSAM) del paquete STATGRAF 5.1, asumiendo
p0.05%.

La comparación en el 1er. ensayo de los
diluyentes tris y citrato de Na al 2.9% mostró diferencias
significativas de IM, causadas principalmente por daño
osmótico, manifiesto por la inflexión de los
flagelos espermáticos en la fracción diluida en
citrato de Na sin la adición del tensido. La
alteración no se observó en tris. Tanto en tris
como en citrato de Na el efecto favorable del tensido sobre la
integridad de los acrosomas fue significativo.

En el 2º ensayo, con el cambio comparativo de la
formulación del diluyente citrato de Na por la
adición de sulfanilamida, que elevó la osmolaridad
y el pH, se repitió lo observado en el ensayo anterior: el
efecto significativo del tensido sobre AN en tris y citrato de Na
como también sobre IM en ambas formulaciones del diluyente
citrato de Na.

En el 3er. ensayo, destinado a comparar la sobrevivencia
espermática en dos concentraciones del diluyente citrato
de Na (2.9% vs. 3.1%), y a comparar un posible efecto
deletéreo de la dilución rápida frente a una
dilución lenta, no hubo diferencia entre las
concentraciones del citrato de Na, como tampoco hubo una
diferencia estadísticamente significativa entre ambas
velocidades de dilución. El efecto del tensido sobre AN
fue nuevamente significativo, como también sobre IM, al
considerar las diferentes fracciones en conjunto.

En el 4º ensayo, destinado a probar el efecto de
una dilución lenta con diluyente tris, no se apreciaron
diferencias frente a la dilución rápida. Nuevamente
las fracciones con el tensido mostraron valores de AN
significativamente mayores, tendencia que para IM sólo fue
significativa al considerar la muestra en conjunto.

De los ensayos se concluyó que diluyentes de
citrato de Na sin surfactante son mal tolerados por
espermatozoides ovinos, que presentaron múltiples
inflexiones flagelares espermáticas como señal de
shock osmótico consecutivo a la dilución. Dicha
alteración no se observó con el surfactante. La
adición del surfactante al diluyente tris permitió
recuperar cerca del 60% más de espermatozoides
aparentemente intactos después de la congelación,
lo cual permitiría reducir la cantidad de espermatozoides
congelados por dosis, factor que, por su parte, también
favorece la sobrevivencia espermática del semen ovino
crioconservado.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Centro de Inseminación
Artificial y a la Unidad Ovina de la Universidad
Austral de Chile, Valdivia, que otorgaron personal de apoyo
y permitieron el uso de sus animales e
infraestructura; al Dr. B. Mercado por su colaboración
durante la realización de los ensayos
experimentales.

BIBLIOGRAFÍA

AMANN, R.P., B.W. PICKETT. 1987. Principles of
cryopreservation and a review of cryopreservation of stallion
spermatozoa, Equine Vet. Sci. 7: 147-173.

ANDERSEN, K., J. AAMDAL, J.A. FOUGNER. 1973.
Intrauterine and deep cervical insemination with frozen semen in
sheep, Zuchthyg. 8: 113-118.

ARRIOLA, J., R.H. FOOTE. 1987. Glycerolation and thawing
effects on bull spermatozoa frozen in detergent-treated egg yolk
and whole egg extenders, J. Dairy Sci. 70: 1664-1670.

COCHRAN, J.D., R.P. AMANN, D.P. FROMAN, B.W. PICKETT.
1984. Effect of centrifugation, glycerol level, cooling to
5°C, freezing rate and thawing rate on the post-thaw motility
of equine sperm, Theriogenology 21: 25-39.

EIBL, K. (editor). 1978. Lehrbuch für den
Besamungsbeauftragten (2. Auflage). Besamungsverein Neustadt a.d.
Aisch e.V.

FOOTE, R.H., J. ARRIOLA. 1987. Motility and fertility of
bull sperm frozen-thawed differently in egg yolk and milk
extenders containing detergent, J. Dairy Sci. 70:
2642-2647.

GRAHAM, E.F., A.H. RAJAMANNAN, M.K.L. SCHMEHL, M.
MAKILAURILA, R. BOWER. 1971. Preliminary report on procedure and
rationale for freezing boar semen, A.I. Digest 1:
12-25.

GRAHAM, E.F., B.G. CRABO. 1972. Some factors influencing
the freezing of boar spermatozoa. Proc. 7th. Int. Cong. Anim.
Reprod., München 1972, Vol. 2, pp. 1627.

HABERMEHL, G. 1987. Citado por M. STROHMEYER. 1988.
Tiefgefrierung von Ziegenbocksperma unter besonderer
Berücksichtigung der Saisonalität sowie der
Zentrifugation und der Verwendung eines Detergens. Hannover,
Tierärztl. Hochsch., Diss.

HALBERT, G.W., H. DOBSON, J.S. WALTON, B.C. BUCKRELL.
1990a. The structure of the cervical canal of the ewe,
Theriogenology 3: 977-992.

_______. 1990b. A technique for transcervical
intrauterine insemination of ewes, Theriogenology 5:
993-1010.

HALBERT, G.W., H. DOBSON, J.S. WALTON, P. SHARPE, B.C.
BUCKRELL. 1990c. Field evaluation of a technique for
transcervical intrauterine insemination of ewes, Theriogenology
33: 1231-1243.

HELLEMANN, C. 1976. Motilität und
Akrosomintegrität als Fruchtbarkeitsparameter von
tiefgefrorenem Kaninchensperma. Hannover, Tierärztl.
Hochsch. Diss.

HELLEMANN, C., M. GONZALEZ, A. GUZMAN. 1992. Efecto de
yema de huevo en polvo, un surfactante y centrifugación en
la sobrevivencia de espermatozoides caprinos congelados, Arch.
Med. Vet. 24(2): 23-30.

KRISTINSSON, G., H. WISSDORF. 1985. Bau der Cervic uteri
und Verlauf des Canalis cervicis uteri beim Schaf,
Tierärztl. Praxis 13:
299-305.

MANN, T. 1964. (editor). The biochemistry of semen and
of the male reproductive tract. Butler & Tanner Ltd., Frome,
Gr. Britain.

MARTIN, J.C., E. KLUG, A.R. GÜNZEL. 1978.
Investigations on centrifugation of stallion semen and storage in
large volume straws. 2nd. Int. Symposium on Equine Reproduction.
Davis, California, 24-28.07.

MERCADO, R.B. 1978. Efecto de la adición de un
surfactante al diluyente tris para conservación de semen
bovino. Tesis de
Magíster en Ciencias
Veterinarias, Mención Reproducción Animal, Universidad Austral de
Chile.

PARKS, J.E., J.K. GRAHAM. 1992. Effects of
cryopreservation procedures on sperm membranes, Theriogenology
38: 209-222.

PURSEL, V.G., L.L. SHULMAN, I.A. JOHNSON. 1978. Effect
of orvus es paste on acrosome morphology, motility and
fertilizing capacity of frozen-thawed boar semen, J. Anim. Sci.
47: 198-202.

QUINN, P.J., P.Y.W. CHOW, I.G. WHITE. 1980. Evidence
that phospholipid protect ram spermatozoa from cold shock at a
plasma membrane site, J. Reprod. Fert. 60: 403-407.

REINHOLD, G., W. ROMMEL, J. SCHULZ. 1987. Untersuchungen
zum anatomischen Aufbau der Cervix uteri des Merinofleischschafes
unter dem Aspekt der künstlichen Besamung, Mh. Vet. Med. 42:
364-368.

SALAMON, S., W.M.C. MAXWELL. 1995a. Frozen storage of
ram semen. I. Processing, freezing, thawing and fertility after
cervical insemination (review), Anim. Repr. Sci. 37:
185-249.

_______. 1995b. Frozen storage of ram semen. II. Causes
of low fertility after cervical insemination and methods of
improvement (review), Anim. Repr. Sci. 38: 1-36.

SALISBURY, G.W., N.L. VANDEMARK. 1961. Physiology of
reproduction and artificial insemination of cattle. W.H. Freemann
& Co, San Francisco and London.

SANCHEZ, M.I. 1994. Efecto de un surfactante en la
crioconservaicón de semen procesado con dos diluyentes con
diferentes concentraciones de glicerina y velocidades de
congelación. Tesis, Universidad Austral de Chile,
Valdivia.

SANCHEZ, M.I., C. HELLEMANN. 1993. Congelación de
semen ovino (abstract), Ciencia e
Investigación Agraria 2(2): 93.

STEINBACH, J., R.H. FOOTE 1966. Osmotic pressure and pH
effect on survival of frozen bovine spermatozoa, J. Dairy Sci.
50: 205-213.

STROHMEYER, M. 1988. Tiefgefrierung von Ziegenbocksperma
unter besonderer Berücksichtigung der Saisonalität
sowie der Zentrifugation und der Verwendung eines Detergens.
Hannover, Tierärztl. Hochsch., Diss.

TEKIN, N. 1982. Untersuchungen zur Samenübertragung
beim Schaf mit tiefgefrorenem Sperma: Einflub verchiedener
Verdünner auf Motilität, Kopfkappenintegrität und
Sephadex-Filtration von in Minitüb konfektioniertem Sperma.
Hannover, Tierärztl. Hochschule, Diss.

VELASCO, J.P. 1985. Die Bedeutung verschiedener
Samenvorbehandlungen für die Tiefgefrierkonservierung von
Ziegenbocksperma. Hannover, Tierärztl. Hochsch.,
Diss.

WEITZE, K.F. 1977. Untersuchungen zur
Tiefgefrierkonservierung von Kaninchensperma. Hannover,
Tierärztl. Hochsch. Habil. Schr.

Notas

1. OEP (Nombre comercial actual "Equex
STM"®).

2. Equex STM®, Nova Chemical Sales Inc., P.O. Box
144, Scituate, Ma. 02066, U.S.A.

C. HELLEMANN, M.V., Dr. Med. Vet.; C. JARA,
T.M.
Centro de Inseminación Artificial,
Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia,
Chile.