Efecto de un surfactante sobre la integridad de espermatozoides ovinos crioconservados
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SUMMARY: Effect of a surfactant on the integrity of
frozen ram
spermatozoa. In order to test the effect
of the addition of the commercial surfactant Equex STM to TRIS
and Na-Citrate extenders on the survival of ram semen, four
trials using factorial designs were conducted freezing separate
ejaculates collected from 2 Austral and l Border Leicester rams.
Common for all trials was a monophasic dilution at room
temperature, with 20% egg-yolk containing extenders split in
fractions with 0.5% and without surfactant, packing of extended
semen in 0.25 Minitüb-straws, an adaptation period at
5°C for 3-4 h, a freezing rate of about 5°C/min performed
10 cm above level of liquid nitrogen, and thawing of straws for
15 seconds in a 40°C water bath. Quality criteria for thawed
semen were motility index (MI) and normal intact acrosomes (NA).
With the use of STATGRAF 5.1, results were submitted to ANOVA and
Duncan test, complemented with "t"-test (TWOSAM), assuming P
< 0.05.
In the 1st trial, the comparison of TRIS-extender (T)
vs. 2.9% Na-Citrate extender (C), MI was significantly lower in
C-extenders, specially in C-extender without surfactant, which
caused high rates of bent tails indicating osmotic damage. This
was not observed in C with surfactant nor in T- fractions. The
effect of surfactant on NA was significant with both extenders.
In the 2nd trial, Citrate extender was comparatively modified,
adding 0.3% (w/v) Sulphanilamide to increase osmolarity and
pH. The
results were basically the same as in the 1st trial: addition of
surfactant gave significantly higher NA-rates in TRIS and Citrate
extenders and significantly higher MI in both Citrate-extenders.
In the 3rd trial, designed to compare two concentrations of
Na-Citrate (2.9% vs. 3.1% w/v), and to compare a fast vs. a slow
dilution, no differences between extenders nor between fast and
slow dilution were found. Again, the effect of the surfactant on
NA and MI was significant. In the 4th trial, conducted mainly to
compare fast and slow dilution with TRIS extender, no difference
was found. Again there was a significant effect of the surfactant
on NA. There was no interaction between tested variables. It
was concluded that Na-Citrate extenders without surfactant are
deleterious to ram spermatozoa, as was evident by bent tails
immediately after dilution. The addition of surfactant to TRIS
extender yielded about 60% more intact spermatozoa after
freezing. This would make it possible to reduce spermatozoa
concentration per frozen straw in order to obtain a better sperm
survival.
Palabras claves: semen, ovino, congelación,
crioprotección, surfactante.
Key words: semen freezing, ram, cryopreservation,
surfactant.
INTRODUCCIÓN
En la especie ovina, la baja fertilidad del semen
crioconservado es atribuida a cambios ultraestructurales,
bioquímicos y funcionales que sufre una proporción
significativa de las células
espermáticas y que conducen a un transporte
insuficiente y pérdida de viabilidad de los
espermatozoides en el tracto genital (Salamon y Maxwell, 1995a,
1995b). Los cambios ultraestructurales afectan principalmente a
las membranas, debido a reordenación de los lípidos
membranosos durante la congelación-descongelación,
alterando las asociaciones lípido-lípido y
lípido-proteínas,
necesarias para una función
normal de las membranas (Parks y Graham, 1992). Se ha constatado
que el daño
por la congelación es más severo en espermatozoides
ovinos que en espermatozoides bovinos, particularmente sobre la
integridad de su borde apical, área que es más
sensible que el segmento postacrosomal y de la pieza intermedia.
Por ello, la motilidad espermática de los espermatozoides
ovinos crioconservados es habitualmente mayor que la integridad
morfológica de sus acrosomas (Salamon y Maxwell,
1995b).
Graham y col. (1971) utilizaron sustancias tenso activas
en ensayos de
criopreservación de semen porcino. Entre 78 compuestos
ensayados, la adición al diluyente de un detergente
comercial (Orvus Es Paste OEP1) demostró tener
un efecto favorable sobre la integridad de los acrosomas en
presencia de yema de huevo. El compuesto comercial utilizado fue
descrito como un tensido constituido por una mezcla de Na- y
trietanolamino-laurilsulfato (STLS). De acuerdo con esa
definición, contiene tanto una sal sódica
anionactiva (dodecilo hidrógeno-sulfato, sal sódica), como
también una sal de etanolamonio (no ionogénica) del
laurilsulfato (Habermehl, 1987).
El efecto favorable del tensido nombrado sobre la
integridad de las membranas de espermatozoides porcinos fue
corroborado por Graham y Crabo (1972) y Pursel y col. (1978),
quienes observaron que su efecto sobre la motilidad
espermática e integridad de acrosomas se relacionaba con
la concentración de yema de huevo en el diluyente de
congelación. El mismo surfactante se ha ensayado
también en semen de otras especies, como conejo
(Hellemann, 1976; Weitze, 1977), equino (Martin y col, 1978),
caprino (Velasco, 1985; Strohmeyer, 1988; Hellemann y col.,
1992), bovino (Arriola y Foote, 1987; Foote y Arriola, 1987) y
ovino (Tekin, 1982; Sánchez y Hellemann, 1993).
El objetivo del
presente trabajo fue
determinar en semen ovino el efecto crioprotector del detergente
Equex STM®, agregado comparativamente a diluyentes tris y
citrato de Na.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se colectó semen de dos carneros de raza Austral
de 2 años y un carnero Border Leicester de 8 años
de edad. Los eyaculados obtenidos mediante vagina artificial se
sometieron a una estimación de porcentaje de motilidad por
microscopía de contraste de fases (x200) sobre platina
temperada (38° a 40°C), descartando del ulterior
procesamiento el semen con menos de 70% de células con
movimiento
progresivo. La concentración espermática se
midió con contador de partículas.
Se realizaron cuatro ensayos. Fue común para
ellos el procesamiento individual de los eyaculados, la
determinación de la concentración
espermática por dosis a un total de 150 millones de
células espermáticas totales. Todos los diluyentes
utilizados tuvieron un contenido final de 20% de yema de huevo.
La concentración de glicerina fue de 6.4% (v/v) en los
diluyentes tris (Steinbach y Foote, 1966) y de 7% (v/v) en los de
citrato de Na (Salisbury y VanDemark, 1961). La dilución
de todas las fracciones se realizó en forma
monofásica, con los diluyentes glicerinados a temperatura de
laboratorio
(18° a 22°C). Las fracciones diluidas se envasaron en
pajuelas Minitüb® de 0.25 ml, las cuales se colocaron
dentro de tubos de aluminio,
sometiéndolas a un período de adaptación a
+5°C por 3 a 4 h antes de su congelación. La
congelación misma se realizó a 10 cm sobre el nivel
de nitrógeno líquido (N2L), por 15 min., en una
caja de poliestireno expandido, logrando una curva de
congelación de aproximadamente 5°C/min, tras lo cual
el semen se sumergió en N2L y almacenó por al menos
una semana.
Se evaluó el efecto de los diferentes
tratamientos en el semen descongelado mediante microscopía
de contraste de fases (x200), por la estimación del
porcentaje de motilidad progresiva (MOT) y de la intensidad del
movimiento (I) en una escala ascendente
de 1 a 5. Ambos parámetros se transformaron a un
índice de motilidad (IM), de acuerdo a la fórmula:
IM = MOT (I x 20) / 100. Como segundo criterio de evaluación
se utilizó el porcentaje de células
espermáticas que mantuvieron la integridad del borde
apical de sus acrosomas (AN), observadas con microscopio de
contraste de fases (x 1000) en semen fijado con una
solución de citrato de Na al 2.9% adicionada con 2% de
formalina comercial al 40%.
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