Evaluación de Cepas Nativas de Bacillus thuringiensis Como una Alternativa de Manejo Integrado de la Polilla del Tomate Tuta absoluta Meyrick en Chile (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

Este trabajo se
desarrolló en el Laboratorio de
Bioquímica
Vegetal, Instituto de Biología Vegetal y
Biotecnología, Universidad de
Talca, Talca, Chile, entre el año 2002 y el año
2003. Se cultivaron plantas de
tomate del
híbrido SSC445, bajo condiciones controladas de luz, temperatura y
con un fotoperíodo 16:8 (luz:oscuridad) a una temperatura
de 25ºC.

La crianza de la larva se efectuó en las
dependencias del Laboratorio de Entomología de la
Universidad de Talca, bajo condiciones controladas. Las larvas se
desarrollaron sobre plantas de tomate del híbrido SSC445.
El inóculo inicial provenía desde invernaderos
ubicados en la comuna de Pencahue (35º 23’ lat. Sur,
71º 50’ long. Oeste), VII Región del
Maule.

Aislamiento de las cepas de Bt

Las cepas de Bt se aislaron desde muestras de suelo
extraídas desde diferentes sistemas
agroecológicos de la VII Región del país
(Vásquez et al., 1995). El procesamiento de estas
muestras se realizó de la siguiente manera: un g de suelo
se mezcló con 10 mL de agua destilada
estéril y se pasteurizó a baño maría
a 65ºC por 30 min. Luego, se dejó en hielo por igual
tiempo y de
éstos sólo 10 mL se aforaron con agua destilada
estéril a un volumen final de
200 mL. Esta suspensión se depositó en placas con
agar LB (Luria Bertani) (10 g triptona, 5 g extracto levadura, 10
g NaCl, por litro) y se dejaron crecer en una cámara a
28ºC.

Las cepas que crecieron en el medio LB con
características morfológicas similares a Bt se
cultivaron aisladamente en un agar nutritivo hasta su autolisis a
una temperatura de 28ºC. Con el cultivo autolisado se
preparó un frotis delgado sobre un portaobjeto. El
material fijado se cubrió con una solución de azul
de Coomasie R-250 al 0,25% en 50% de etanol y 7% de ácido
acético durante 10 min. Se lavó el exceso de
colorante con agua y se dejó secar el frotis a temperatura
ambiente. Los
cuerpos paraesporales se observaron con microscopio
óptico (Nikon E-4000, Tokio, Japón)
con 1250X de aumento.

Como cepa control se
utilizó la cepa B. thuringiensis var.
kurstaki que se regeneró a partir del producto
comercial DipelÒ 2X (Laboratorios Abbott, Chicago, EEUU).
Este procedimiento
consistió en tomar una cantidad pequeña del
producto para restablecer su crecimiento en una placa con medio
LB.

Purificación de cristales
(δ-dotoxinas)

Las cepas se cultivaron en leche
peatonizada (PMB) (10 g leche peptonizada, 10 g dextrosa, 2 g
extracto levadura, 0,3 g MgSO4 x 7H2O, 0,02
mg mL-1 FeSO4 x 7H2O, 0,02 mg
mL-1 ZnSO4 x 7H2O, 0,020 mg
mL-1 MnSO4 x 7H2O en un volumen
final de un litro),  con agitación constante de 300
rpm a 28oC, hasta su completa autolisis.
Posteriormente, el sedimento se colectó por
centrifugación a 10.000 rpm por 10 min, y se lavó
tres veces con agua destilada estéril, eliminándose
el sobrenadante en cada oportunidad. El sedimento resultante se
resuspendió en NaCl 0,5 M a 30ºC por 15 min.
Enseguida, el sedimento se resuspendió en un volumen de
PMSF (fenilmetilsulfonil fluoruro) 1 mM y la suspensión se
sometió a un gradiente lineal de NaBr, preformado entre 30
y 60% (Vásquez et al., 1995). La
centrifugación se realizó a 10.000 rpm por 2 h a
4ºC, utilizando una centrífuga refrigerada (Sorvall,
modelo RC-5B,
Wilmington, Delaware, USA). Al término de la
centrifugación, la banda de cristales se extrajo con una
pipeta Pasteur, se diluyó con agua destilada, y se
concentró por centrifugación. Luego los cristales
se lavaron dos veces con agua destilada estéril y se
recuperaron, en cada ocasión, por centrifugación.
Finalmente, los cristales se congelaron a -80ºC para luego
ser liofilizados y almacenados a 4°C, hasta su
utilización.

Tinción del cuerpo paraesporal

Se preparó un frotis delgado sobre un vidrio
portaobjeto, secándolo a temperatura ambiente y luego,
exponiéndolo suavemente a la llama del mechero. El
material fijado se cubrió con una solución de azul
de Coomassie R-250 al 0,25% en 50% de etanol y 7% de ácido
acético durante 10 min. Se lavó el exceso de
colorante con agua y se dejó secar el frotis a temperatura
ambiente. Los cuerpos paraesporales se observaron al microscopio
óptico (Nikon E-4000) con 1250X de aumento.

Microscopía electrónica de los cristales
proteicos

Una identificación más fina del cuerpo
paraesporal se efectuó mediante observación al microscopio
electrónico de barrido (MEB) (Philips, Modelo XL-30-ESEM,
Irapuato, México),
gentilmente facilitado por el Centro de Investigación de Estudios Avanzados
Querétaro, México.

Se tomaron alícuotas de 10 mL a partir de
suspensiones de esporas y cristales. Éstas se
distribuyeron en la superficie de portaobjetos cilíndricos
de aluminio,
diseñados especialmente para observar en el
MEB.

Una vez que las muestras se secaron, se llevaron a
sombrear con oro por 4 min
en un sombreador de oro (E.F. Fullam, Modelo EMS-76M, California,
USA), utilizando una corriente de 10 A y una bomba de
vacío de alto poder
conectada al sombreador, hasta alcanzar un vacío de 200
mTorr.

Después de concluir el sombreado, se tomaron los
portaobjetos con unas pinzas de plástico y
se colocaron en una caja de Petri que contenía cinta
adhesiva, para transportar así las muestras hasta el
MEB.

Electroforesis de proteínas
paraesporales

La electroforesis analítica de proteínas
se realizó en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturantes, según el procedimiento descrito por Laemmli
(1970).

Obtención de ADN y
amplificación mediante PCR

El aislamiento de ADN de células
vegetativas de Bt se realizó mediante la técnica
descrita por Ceron et al. (1994, 1995). En ésta,
las cepas de Bt aisladas se cultivaron durante 12 h en placas con
agar nutritivo 23 g L-1. Posteriormente, una asada de
colonia se transfirió a un tubo Eppendorf con 0,1 mL de
H2O, y el tubo con la muestra se
mantuvo a –75ºC por 15 min. Luego, el tubo se
calentó a 100oC por 10 min, al término
de los cuales las muestras se sometieron a centrifugación
a 10.000 rpm por 10 s (Eppendorf, modelo 5415 C, Berlin, Alemania). Se
extrajo una alícuota de 10 mL del sobrenadante y una
fracción de esta alícuota se empleó como ADN
molde para el análisis de PCR.

Las secuencias específicas de ADN se amplificaron
mediante la técnica de PCR (Mullis y Faloona, 1987),
utilizando partidores especialmente diseñados (Ceron et
al., 1994, 1995). Los ADNs moldes analizados se aislaron de
las cepas nativas LM-011, LM-012, LM-14 y LM-033. Además,
se analizó una cepa de B. thuringiensis var.
kurstaki del Instituto Pasteur, Francia, y una
cepa de B. thuringiensis var. tenebrionis
gentilmente cedida por el Dr. Jorge Ibarra, Instituto de
Investigación y Estudios Avanzados (CINVESTAV), Unidad
Irapuato, México. Estas dos últimas cepas se
utilizaron como controles de amplificación y ensayo
biológico.

El procedimiento de amplificación del ADN se
realizó en tubos Eppendorf de 100 mL. La mezcla de
reacción, en un volumen final de 25 μL,
estuvo constituida por los siguientes componentes: 2,5 μL de
tampσn 10X (121 g TAE 50 X = trizma base; 28,6
mL ácido acético glacial; EDTA 0,5 M, pH 8,0 y agua
ultra pura, por litro), 2,5 μL MgCl2 2 mM, una
solución de desoxinucleótidos trifosfato (dATP,
dTTP, dCTP, dGTP) en una concentración individual final de
0,2 mM; partidores generales y específicos a una
concentración de 0,2 μM y 1,25 U de Taq
polimerasa. Por ensayo se utilizaron 100 ng de ADN purificado por
el procedimiento descrito anteriormente. La amplificación
se efectuó utilizando dos programas, ambos
descritos por Ceron et al. (1994, 1995).

Los productos de
amplificación se analizaron mediante electroforesis en
geles de agarosa (García, 2000) al 3% p/v en
solución amortiguadora TAE 1X.

Análisis Western

El análisis inmunológico de las
δ-dotoxinas de las cepas de Bt se realizó utilizando
anticuerpos policlonales contra la toxina de 130 kDa de la cepa
de referencia var. kurstaki HD-1, desarrollados en conejo
(Meza-Basso et al., 1993). Las proteínas separadas
en geles de poliacrilamida se transfirieron a membranas de
nitrocelulosa y se procesaron de acuerdo al procedimiento
descrito por Tsang et al. (1983).

Bioensayos

Se prepararon placas Petri (6 cm diámetro) con
una hoja de tomate en su interior fenológicamente iguales
y sin previa aplicación de plaguicida. Las hojas se
lavaron con agua y Tween 20 al 0,3% y luego se secaron con papel
absorbente. Cada hoja se sumergió y agitó
suavemente por 2 min en las diferentes concentraciones de
protoxina aislada del Bt en estudio, se secaron sobre una
superficie no absorbente y se transfirieron al interior de una
placa Petri. Para evitar la deshidratación, se
colocó un algodón
humedecido con agua destilada al pecíolo de cada
hoja.

Los insectos para el bioensayo fueron larvas neonatas de
Tutaabsoluta. Se analizaron cinco dosis por tratamiento
(1,56; 3,12; 6,25; 12,5 y 25 mg mL-1) con 10 larvas
cada una. En todos los ensayos se
empleó un insecto por placa Petri, por lo tanto, en los
análisis cada unidad experimental correspondió a
una larva (Jonhson et al., 1991).

Los controles correspondieron a hojas sumergidas en agua
destilada estéril ajustada a pH 10,5. Las condiciones del
ensayo fueron 25ºC, con un fotoperíodo de 16:8
(luz:oscuridad). Las cepas evaluadas fueron las siguientes:
LM-011, LM-012, LM-14, LM-033 y B. thuringiensis var.
kurstaki (Dipel), esta  última empleada como
control. Cada dosis se preparó con la proteína
liofilizada en 25 mL de agua destilada estéril ajustada a
pH 10,5. Se mezcló mecánicamente por 2 h y se
incubó a 37ºC por 15 h (Theoduloz et al.,
2003).

El diseño
experimental utilizado fue completamente al azar, con 5
tratamientos y diez repeticiones; la unidad experimental
consistió en una larva de Tuta absoluta.

La mortalidad se evaluó cada 24 h, siendo la
duración del bioensayo 144 h. Los porcentajes de
mortalidad se corrigieron de acuerdo a la formula de Abbott
(Abbott, 1925) y los valores de
CL50 (concentración letal 50) y TL50
(tiempo letal 50) se analizaron con el análisis Probit
(Moermans y Hecke, 1995), utilizando el programa
computacional SPSS 7.0 (SPSS, 1996). Los porcentajes obtenidos de
mortalidad para cada cepa se analizaron con el programa
computacional NCSS (NCSS, 1997).

RESULTADOS Y
DISCUSIÓN

Aislamiento de cepas nativas

Se aislaron colonias de Bt a partir de muestras de suelo
en medio sólido LB. Las colonias rescatadas fueron
grandes, de bordes irregulares, opacas, rugosas y
sobrelevantadas, propiedades que son características del
género
Bacillus.

Se logró esporulación completa en medio
líquido (leche peptonizada) entre 6 y 8 días de
cultivo. Al cabo de este tiempo se logró la
liberación del cristal tóxico para cada una de las
cepas en estudio.

Microscopía óptica
y electrónica

La observación de los cuerpos paraesporales
mediante microscopía óptica, comprobó la
presencia de abundantes cristales bipiramidales en los cultivos
de todas las cepas nativas en estudio (LM-011, LM-012, LM-14 y
LM-033), así como en la cepa control Bt var.
kurstaki HD-1. La Figura 1 muestra el resultado de la
microscopía electrónica de barrido efectuada sobre
la cepa LM-033. Se aprecian en gran número cristales de
morfología
bipiramidal y la presencia de algunas esporas. La flecha indica
un cristal de forma romboidal que podría corresponder a un
cristal proteico Cry3, pero sólo se observa uno. Este
resultado podría ser explicado por un bajo nivel de
expresión para este gen debido a tres posibles causas: 1)
la existencia en algunos casos de un solo promotor, 2) por una
pobre estabilización del ARNm, y 3) por una
degradación de los nacientes polipéptidos. Lo
anterior podría ser atribuido al hecho que estos genes son
truncados naturalmente en su zona 3`, la cual interviene en la
estabilización del ARNm y también facilita la
cristalización (Park et al., 1998). Lo anterior
explicaría el hallazgo de sólo un cristal de forma
romboidal en la microscopía electrónica.

Figura 1. Microscopía
electrónica de barrido de Bacillus thuringiensis
cepa LM-033, mostrando la morfología bipiramidal
típica de las cepas del patotipo I. A = cristal cuadrado,
B = espora, C = cristal bipiramidal, D = posible
polihidroxibutirato (PHB). La barra en cada fotografía
representa 2 mm.
Figure 1. Scanning electron micrograph of Bacillus
thuringiensis strain LM-033, showing the typical bipiramidal
morphology I pathotype strains. A = square crystal, B = spore, C
= bipiramidal crystal, D = a possible polyhydroxybutyrate
polihidroxibutirato (PHB). Scale bar: 2 mm.

Determinación del contenido génico
mediante la amplificación por PCR

A fin de precisar la naturaleza de
los genes cry presentes en las cepas nativas de Bt en
estudio, éstas fueron analizadas mediante la
técnica de PCR, empleando partidores generales y
específicos.

En el caso de la cepa LM-033, se observó una
banda cercana a los 300 pares de bases (pb) cuando los partidores
utilizados fueron los generales CJI-1/CJI-2, y una banda de 700
pb cuando la pareja de partidores empleados fue CJIII20/CJIII21,
que son específicos para los genes cry3. La
existencia de esta banda indicaría que la cepa LM-033
contendría  un gen de la familia
cry3. Sin embargo, el empleo de
estos partidores generales no permitió discriminar a
cuál subfamilia cry3 pertenecería. De
acuerdo a la información disponible (Ceron et
al., 1995) estos partidores reconocen secuencias presentes en
los ADNs de las subfamilias cryIIIA hasta cryIIIF
(en nomenclatura
nueva cry3Aa1-cry3Ca1; cry7Aa1-cry8Aa1,
respectivamente). Con la pareja de partidores mencionada, los
productos de amplificación esperados para estas
subfamilias fluctúan entre los 652 pb y los 718 pb. Estas
diferencias de tamaño fueron imposibles de resolver
mediante el análisis electroforético. Por lo tanto,
esta cepa contaría con dos genes cry. El primero de
éstos podría codificar para toxinas activas contra
el Orden Lepidóptera (cry1), en tanto, el segundo
podría codificar para toxinas activas contra el Orden
Coleóptera (cry3). Al analizar la cepa B.
thuringiensis var. kurstaki con los partidores
CJIII20/CJIII21, no se observó amplificación
alguna. Este resultado era esperable, pues esta cepa no posee
genes de la familia
cry3, por tal razón fue ocupada como control
negativo (Figura 2).

Figura 2.
Análisis electroforético en un gel de agarosa al 2%
de los productos de PCR, usando los partidores generales
CJI-1/CJI-2 y CJIII-20/CJIII-21. Carril 1, marcador de peso
molecular (50 pb); Carril 2, cepa LM-033 (CJIII-20/CJIII-21);
Carril 3, cepa LM-033 (CJI-1/CJI-2); Carril 4, Bacillus
thuringiensis var. kurstaki (CJIII20/CJIII21) (Control
negativo).
Figure 2. Electrophoretic analysis of PCR products in a 2%
agarose gel, using the nonspecific primers, CJI-1/CJI-2 and
CJIII-20/CJIII-21. Lane 1, 50 pb DNA ladder; Lane 2, strain
LM-033 (CJIII-20/CJIII-21); Lane 3, strain LM-033 (CJI-1/CJI-2);
Lane 4, Bacillus thuringiensis var. kurstaki
(CJIII20/CJIII21) (Negative control).

La mezcla de partidores CJ1-CJ7 (MixA) fue ensayada con
todas las cepas en estudio. Esta combinación de partidores
permite discriminar algunos genes cry1. La Figura 3
muestra que los patrones de amplificación de las cepas
B. thuringiensis var. kurstaki, LM-14 y cepa LM-012
son muy similares, generando productos de amplificación de
250, 216 y 180 pb. La cepa LM-14, además de estos
productos de amplificación, presentó una banda
tenue a la altura de los 400 pb, que no fue posible de capturar
fotográficamente.

Figura 3.
Análisis electroforético en un gel de agarosa al 3%
de los productos de PCR, usando el Mix A (CJ1 al CJ7). 
Carril 1, marcador de peso molecular (100 pb); Carril 2, cepa
Bacillus thuringiensis var. kurstaki; Carril 3,
cepa LM-14; Carril 4, cepa LM-011 y Carril 5, cepa LM-012.
Figure 3. Electrophoretic analysis of PCR products in a 3%
agarose gel, using Mix A (CJ1 to CJ7). Lane 1, 100 pb DNA ladder;
Lane 2, strain Bacillus thuringiensis var.kurstaki;
Lane 3, LM-14 strain; Lane 4, strain LM-011 and Lane 5, strain
LM-012.

Estas tres cepas contendrían genes de la familia
cry1A, y más específicamente los genes
cry1Aa, cry1Ab y cry1Ac. Para el caso de
nuestra cepa de referencia kurstaki, se esperaba la
amplificación de estos genes, pues corresponden a su
composición génica descrita (Ceron et al.,
1994).

Como se observa en la Figura 3, la cepa nativa LM-011
sólo amplificó una banda a la altura de las 216 pb,
lo que indicaría que este aislado contendría un gen
de la subfamilia cryIAb.

La mezcla de partidores CJ8 al CJ13 fue ensayada con
todas las cepas en estudio. Esta combinación de partidores
permite discriminar otros genes cry1. Sólo la cepa
LM-14 amplificó una banda de 290 pb (cryID) (Figura
4), lo que indicaría la existencia de genes que codifican
para las proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac y
Cry1D.

Figura 4.
Análisis electroforético en un gel de agarosa al 2%
de los productos de PCR, usando el Mix B (CJ8 al CJ13). 
Carril 1, marcador de peso molecular (100 pb); Carril 2, cepa
Bacillus thuringiensis var. kurstaki; Carril 3,
cepa LM-14; Carril 4, cepa LM-011; Carril 5, cepa LM-012 y Carril
6, control negativo.
Figure 4. Electrophoretic analysis of PCR products in a 2%
agarose gel, using a mix of primers (CJ8 to CJ13). Lane 1, 100 pb
DNA ladder; Lane 2, strain Bacillus thuringiensis var.
kurstaki; Lane 3, LM-14 strain; Lane 4, strain LM-011;
Lane 5, strain LM-012 and Lane 6, negative control.

Estos perfiles de amplificación que orientan
acerca del contenido génico de cada cepa de Bt en estudio
fueron conseguidos con los partidores anteriormente descritos.
Sin embargo, los resultados no significan que el contenido
génico encontrado para estas cepas sea el definitivo. La
amplificación, utilizando otros partidores, podría
indicar la presencia de genes cry adicionales a los
encontrados. Esta situación explicaría el hecho que
cepas que aparentemente tienen los mismos genes, tengan una
respuesta diferente ante un mismo insecto blanco. Sin desmedro de
lo anterior, se debe considerar que la presencia de un gen
cry, detectado mediante PCR, no necesariamente significa
que ese gen sea expresable y que pueda conducir a la síntesis
de la proteína correspondiente. Por otra parte, la
región promotora de cada gen individual podría ser
más o menos eficiente en promover la transcripción
del mismo, dando como resultado que una cepa en particular
sintetice proteínas insecticidas de la misma subfamilia o
familia, en diferente proporción. De esta forma, cepas con
igual contenido génico podrían sintetizar un
conjunto de proteínas insecticidas con una
composición relativa diferente. Estas diferencias
eventuales en la composición relativa podría
explicar la respuesta diferencial de su actividad
biológica.

Electroforesis de proteínas
paraesporales

El análisis electroforético de los
cristales de cada cepa fue otro criterio de selección,
pues permitió visualizar diferencias a nivel del
tamaño de las proteínas sintetizadas por la
bacteria. De esta forma, se seleccionaron aquellos aislados en
que no se repita su perfil electroforético. La Figura 5
muestra que todas las cepas en estudio presentan proteínas
que fluctúan entre los 130 a 135 kDa, y se distinguen
entre sí, por la presencia de otras bandas de
tamaños diferentes.  

Figura 5. Análisis SDS-PAGE.
Carril 1, marcador de peso molecular (SDS-6H): miosina (205 kDa);
b-galactosidasa (116 kDa); fosforilasa (97,4 kDa);
albúmina bovina (66 kDa); albúmina huevo (45 kDa) y
anhidrasa carbónica (29 kDa); Carril 2, cepa LM-011;
Carril 3, Cepa LM-012; Carril 4; cepa LM-14; Carril 5, cepa
LM-033 y Carril 6, cepa Bacillus thuringiensis var.
tenebrionis.
Figure 5. SDS-PAGE analysis. Lane 1, molecular weight markers
(SDS-6H); myosin (205 kDa); b-galactosidase (116 kDa);
phosphorilase (97,4 kDa); bovine albumin (66 kDa); egg albumin
(45 kDa) and carbonic anhydrase (29 kDa); Lane 2, strain LM-011;
Lane 3, strain LM-012, Lane 4, strain LM-014; Lane 5, strain
LM-033 and Lane 6, strain Bacillus thuringiensis var.
tenebrionis.

Análisis Western

La Figura 6 da cuenta del resultado del reconocimiento
inmunológico positivo de todas las cepas nativas en la
región de los 130 kDa, exceptuando la muestra proteica
proveniente de B. thuringiensis var. tenebrionis
que fue empleada como control negativo. El antisuero
reaccionó además con polipéptidos de
aproximadamente 65 kDa en el mismo carril.

Figura 6.
Análisis Western Blot. Carril 1, marcador peso molecular
(SDS-7B): a-macroglobulina (180 kDa); b-galactosidasa (116 kDa);
fructosa-6 fosfatasa quinasa (84 kDa); piruvato quinasa (58 kDa);
Carril 2, Bacillus thuringiensis var. kurstaki
HD-1; Lane 3, cepa LM-011; Carril 4, cepa LM-012; Carril 5, cepa
LM-14; Carril 6, cepa LM-033 y Carril 7, cepa Bacillus
thuringiensis var. tenebrionis (Control negativo).
Figure 6. Western blot analysis. Lane 1, molecular weight markers
(SDS-7B): a-macroglobulin (180 kDa); b-galactosidase (116 kDa);
fructose-6-phosphate kinase (84 kDa); pyruvate kinase (58 kDa);
Lane 2, Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1
used as a positive control; Lane 3, strain LM-011; Lane 4, strain
LM-012; Lane 5, strain LM-14; Lane 6, strain LM-033 and Lane 7,
strain  Bacillus thuringiensis var.
tenebrionis (Negative control).

Adicionalmente, las proteínas cristalinas de la
cepa nativa LM-033 fueron analizadas utilizando anticuerpos
contra la proteína Cry3A, dando un resultado negativo.
Vale decir, no fue posible observar la aparición de una
banda que indique que esta cepa sintetice esta clase de
proteína.

Bioensayos

En la Figura 7 se observa que todas las cepas estudiadas
presentaron una mejor actividad biológica que el control
Bt var. kurstaki, cepa regenerada desde el producto
comercial Dipel, en consideración a que  los
porcentajes de mortalidad obtenidos fueron superiores. En el caso
de la cepa LM-011, la máxima mortalidad obtenida fue de un
90%, en contraste a la obtenida por el control que sólo
alcanzó al 40%. Se aprecia que no existió una
correlación entre dosis y porcentaje de mortalidad, debido
a que todas las mediciones presentaron fluctuaciones. Este
resultado podría ser explicado por la forma en que la
larva se alimenta, la cual es básicamente del
mesófilo y también por el hecho que la
solución asperjada no es translaminar. Por lo tanto, el
único momento en que la larva puede ingerir la protoxina
es cuando rompe la epidermis de la hoja, ya sea para ingresar o
salir del mesófilo. Debido al método de
inmersión y a la anatomía de las hojas
es probable que no se hubiese obtenido una distribución homogénea de la
protoxina sobre la superficie de la hoja. Por lo tanto, si la
larva ingresa a la hoja por un sector en donde no haya quedado
protoxina, ésta no será ingerida, lo que
traerá como consecuencia la sobrevivencia de la larva. Por
tal motivo, es probable que este método no sea el
más adecuado para el análisis del grado de
toxicidad de las cepas en estudio, pero sí permite
entregar un indicio del comportamiento
a nivel de campo. No obstante, es posible diferenciar aquellas
cepas que presentaron claramente una mejor respuesta relativa a
la cepa control Dipel (kurstaki). De acuerdo a estos
antecedentes, sería aconsejable recurrir al empleo de
plantas transgénicas que expresen el gen de la toxina en
aquel tejido donde se alimenta esta plaga, con lo cual se
lograría un mejor control.

Figura 7.
Actividad insecticida de las cepas en estudio sobre larvas de
primer estadio de Tuta absoluta medida a las 144 h.
Figure 7. Insecticidal activity of the strains in study on the
first  instar Tuta absoluta measured at
144 h.

La Figura 8 muestra el efecto de la toxina en función
del tiempo. Este resultado se explica por la forma de actuar de
la toxina, debido a que ésta debe ser ingerida para
desencadenar todo el proceso
infectivo. La muerte no
se produce en forma inmediata, sino que pasan varias horas o
días para observar los primeros
síntomas.

Figura 8.
Actividad insecticida media de las cepas de Bacillus
thuringiensis  sobre larvas de primer estadio de Tuta
absoluta en función del tiempo. Cada tiempo
corresponde al promedio obtenido entre todas las observaciones
sin considerar la dosis.
Figure 8. Mean insecticide activity of Bacillus
thuringiensis strains on first instar of Tuta absoluta
larvae over as a function of time. Every Each time corresponds to
the average obtained between among all the observations without
considering the dose.

Ferré y Van Rie (2002) afirman haber encontrado
los primeros indicios de resistencia a
Dipel (Bacillus thuringiensis var. kurstaki),
observando una disminución de 100 veces en la
susceptibilidad del insecto (Plodia interpunctella). Estos
autores afirman que al cambiar la cepa de Bt por una con un
contenido génico diferente a la familia cry1A, el
insecto volvía a ser susceptible. El ensayo
biológico demostró que al emplear toxinas de una
cepa que contenía el gen cry1Ca, se obtuvo una
susceptibilidad 800 veces superior. Por otra parte,
Vásquez et al. (1995) evaluaron la mortalidad de
T. absoluta producida por Bt var. kurstaki con
dosis similares a las ensayadas en el presente trabajo,
obteniendo valores de
mortalidad superiores a los encontrados en esta
investigación.

La CL(50) y el TL(50) no fueron
obtenidos para cada cepa, debido a las fluctuaciones que
presentó la mortalidad en las distintas dosis analizadas.
Lo anterior implicó no encontrar la regresión
lineal necesaria para la interpolación de dichos
valores, pero sí permitieron diferenciar estos porcentajes
de mortalidad obtenidos estadísticamente (Cuadro
1).

Cuadro 1.
Análisis estadístico de las cepas evaluadas en
función al porcentaje de mortalidad.
Table 1. Statistical analysis of the strains evaluated in
function to percentage of mortality.

De las cepas estudiadas, las que ofrecen mayores
potencialidades serían las cepas LM-11, LM-012 y LM-033,
pues con éstas se logró sobre un 50% de mortalidad
con la dosis más baja.

Las larvas afectadas por la toxina mostraron los
síntomas descritos por Lamborot y Araya (1986). En las
larvas se percibió una disminución del apetito
hasta dejar de alimentarse, permaneciendo inactivas e
inmóviles. La inactividad continuó con descargas
líquidas orales y anales, y finalmente, la muerte del
insecto. Además, en un porcentaje pequeño (2%) se
observaron efectos teratogénicos a nivel de pupa. Se
advirtió la presencia de adultos incapaces de salir de la
envoltura pupal y extender sus alas (Figura 9). Un daño
similar fue observado por Liu et al. (2001), quienes
informaron además, el efecto de la toxina Cry1Ac sobre el
peso de la pupa del lepidóptero Pectinophora
gossypiella. Los autores señalan que con 0,1 μg de
toxina por gramo de dieta, se redujo el peso de la pupa desde 23
a 9,9 mg.

Figura 9.
Apariencia de larvas y pupas de Tuta absoluta. (A, B, C:
después de ingerir Bacillus thuringiensis  y
D: larva no tratada).
Figura 9. Appearance of larvae and pupae of Tuta absoluta
(A, B, C: after ingesting Bacillus thuringiensis and D,
untreated larvae).

CONCLUSIONES

1.- Para la familia génica cry1A, desde el
punto de vista molecular y serológico, es posible concluir
la existencia de una correlación entre el contenido
génico y la naturaleza de las proteínas
sintetizadas. 

2.- La presencia de un determinado gen cry en las
cepas evaluadas no siempre está asociada a su
transcripción y traducción en su correspondiente
proteína.

3.- Todas las cepas estudiadas demostraron ser
más efectivas que el control sin Bt y el control positivo
Dipel (Producto comercial, Bacillus thuringuiesis var.
kurstaki).

 4.- Los bioensayos permiten concluir que bajo
estas condiciones, todas las cepas evaluadas sintetizan
proteínas con actividad insecticida sobre la larva de la
polilla del tomate Tuta absoluta.

RECONOCIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo financiero del Centro de
Investigación en Biotecnología
Silvoagrícola, Programa CONICYT/Regiones y al Programa de
Investigación en Biotecnología Vegetal, Universidad
de Talca.

LITERATURA CITADA

Abbott, W.S. 1925. A method of computing the
effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol.
18:265-267.

Aronson, A., and Y. Shai. 2001. Why Bacillus
thuringiensis toxins are so effective: unique features of
their mode of action. FEMS Microbiol. Lett. 195:1-8.

Ceron, J., L. Covarrubias, R. Quintero, A. Ortiz, M.
Ortiz,  E. Aranda et al.1994. PCR analysis of the
cryI insecticidal crystal family genes from Bacillus
thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol.
60:353-356.

Ceron, J., A. Ortiz, R. Quintero, L. Guereca, and A.
Bravo. 1995. Specific PCR primers direct to identify cryI
and cryIII genes within a Bacillus thuringiensis
strain collection. Appl. Environ. Microbiol.
61:3826-3831.

Crickmore, N., E. Bone,  J. Williams, and D. Ellar
1995. Contribution of the individual components of
the δ-dotoxin crystal to the mosquitocidal activity
of Bacillus thuringiensis subsp.
israelensis. FEMS Microbiol. Lett. 131:249-254.

Crickmore,N., Zeigler, D., Feitelson, J., Schnepf, E.,
Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., and Dean, D. 1998.
Revisión of the Nomenclature for the Bacillus
thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins. Microbiol. and
Molecul. Biology Reviews 62: 807 -813.

Feitelson, JS. 1993. The Bacillus thuringiensis
family tree. p. 63-71. In Kim L. (ed.) Advanced engineered
pesticides. Marcel Dekker Inc., New York, USA.

Ferré, J., and J. Van Rie. 2002. Biochemistry and
genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis.
Annu. Rev. Entomol. 47:501-533.

García, H. 2000. Electroforesis en geles de
poliacrilamida: fundamentos, actualidad e importancia. Univ.
Diag. 1(2):31-41.

Gill, S., E. Cowles, and P. Pietrantonio. 1992. The mode
of action of Bacillus thuringiensis endotoxins. Annu. Rev.
Entomol. 37:615-36.

Giustolin, T., J. Vendramin, S. Alves, A. Viera, and R.
Pereira. 2001. Susceptibility of Tuta absoluta (Meyrick)
(Lep., Gelechiidae) reared on two species of Lycopersicon
to Bacillus thuringiensis var. kurstarki. J. Appl.
Entomol. 125:551556.

Höfte, H. and R. Whiteley. 1989. Insecticidal
cristal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiol.
Rev. 53:242-255.

Jonhson, D., W. McGaughey, and B. Barnett. 1991. Small
scale bioassay for the determination of Bacillus
thuringiensis toxicity toward Plodia interpunctella.
J. Invertebr. Pathol. 57:159-165.

Kwang-Bo, J., and J. Cóte. 2002. A review of the
environmental impacts of the microbial insecticide Bacillus
thuringiensis. Agriculture and Agri-Food Canada. Available
at .
Accessed 8 October 2003.

Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins
during the assembly of the head of Bacteriophage T4. Nature
227:680-685.

Lamborot, L., and J. Araya. 1986. Antecedentes sobre
Bacillus thuringiensis, una bacteria selectiva para
controlar insectos. Acta Entomol. Chil. 13:183-189.

Larraín, P. 1986. Plagas del tomate.
Investigación y Progreso Agropecuario Nº 39 p.
30-35.

Liu, Y., B. Tabashnik, T. Dennehy, A. Patin, M. Sims, S.
Meyer, and Y. Carriere. 2001. Effects of Bt cotton and Cry1Ac
toxin on survival and development of pink bollworm (Lepidoptera:
Gelechiidae). J. Econ. Entomol. 94:1237-1242.

Maagd, R., A. Bravo, and N. Crickmore. 2001. How
Bacillus thuringiensis has evolved specific toxin to
colonize the insect world. Rev. Trend. Genet.
17:193-199.

Meza-Basso, L., P. Espinoza, C. Theoduloz, M.
Vásquez, C. Parra, J. Zúñiga et al.
1993. Cepas nativas de Bacillus thuringiensis: Una nueva
fuente de biopesticidas y su proyección
biotecnológica. Simiente 2:71-81.

Moermans, R., and P. Hecke. 1995. Effect of sample size
and number of doses for the determination of LD50. J. Appl.
Entomol. 119:637-642.

Mullis, K., and F. Faloona. 1987. Specific synthesis of
DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.
Methods Enzymol. 155:335-350.

NCSS. 1997. NCSS Statistical program, System for
Windows.
Published by NCSS, Kaysville, Utah, USA.

ODEPA. 2005. Estadísticas macrosectoriales y
productivas. Disponible en http://www.odepa.gob.cl/  
Leído el 26 de septiembre del 2005.

Park, H., B. Ge, L. Bauer, and B. Federici. 1998.
Optimization of Cry3A yields in Bacillus thuringiensis by
use of sporulation-dependent promoters in combination with the
STAB-SD mRNA secuence. Appl. Environ. Microbiol.
64:3932-3938.

Salazar, E., y J. Araya. 1997. Detección de
resistencia a insecticidas en la polilla del tomate. Simiente
67:8-22.

SPSS. Inc. 1996. SPSS. Base 7.0 for Windows computer
program manual. 560 p.
Statsoft. Inc. Tulsa, Oklahoma, USA.

Theoduloz C., A.Vega, M. Salazar, E. González,
and L. Meza-Basso. 2003. Expression of a Bacillus
thuringiensis δ-dotoxin
cry1Ab gene in Bacillus subtilis
and Bacillus licheniformis strains that naturally colonize
the phylloplane of tomato plants (Lycopersicon esculentum
Mill.).  J. Appl. Microbiol. 94:1-7.

Tsang, V., J. Peralta, and A. Simons. 1983.
Enzyme-linked immunoelectrotransfer beat techniques (EITB) for
studying the specifities of antigens and antibodies separated by
gel electrophoresis. Methods Enzymol. 92:377-391.

Vásquez, M., C. Parra, E. Hubert, P. Espinoza, C.
Theoduloz, and L. Meza-Basso. 1995. Specificity and insecticidal
activity of Chilean strains of Bacillus thuringiensis. J.
Invert. Pathol. 66:143-146.

Yamamoto, T., and G. Powell. 1993. Bacillus
thuriengiensis crystal proteins: Recents advances in
understanding its insecticidal activity. p. 3-42. In Kim,
L. (ed.). Advances in engineered pesticides. Marcel Dekker Inc.,
New York, USA

Lorena Niedmann Lolas1 y Luis
Meza-Basso2
1 Universidad de Talca,
Centro de Investigación en Biotecnología
Silvoagrícola,  Casilla 747, Talca, Chile.
2 Universidad de Talca, Instituto de Biología
Vegetal y Biotecnología, Casilla 747, Talca,
Chile.