Anticuerpos policlonales antiinmunoglobulinas de salmón: Herramientas potenciales para diagnóstico
Publicación original: |
RESUMEN: A partir de sueros de
salmón del Atlántico (Salmo salar) se han
purificado sus inmunoglobulinas (Igs) mediante
precipitación con sulfato de amonio al 50% de
saturación, seguido de cromatografía de exclusión por
tamaño molecular en Sephacryl S-300. La fracción de
Igs purificadas fue utilizada como inmunógeno para generar
un anticuerpo policlonal anti-Igs de salmón, el cual fue
purificado por afinidad usando Sefarosa-proteína G.
Mediante ensayo
inmunorradiométrico contra el inmunógeno, la IgG
anti-Igs de salmón demostró un elevado
título (a lo menos 1/100.000) específico para el
antígeno. El anticuerpo generado ofrece la
posibilidad de detectar respuestas humorales en salmón y
trucha (reactividad cruzada), con fines diagnósticos o de
investigación.
Palabras claves: anticuerpos
policlonales, salmón, diagnóstico.
SUMMARY: Polyclonal antibodies anti-salmon
immunoglobulins; potential tools for diagnosis.
Immunoglobulins (Igs) from sera of Atlantic salmon (Salmo
salar) were purified with 50% saturated ammonium sulphate
followed by molecular sieving chromatography using Sephacryl
S-300. The fraction of purified Igs was used as immunogen to
generate a polyclonal antibody anti-salmon Igs. This antibody was
affinity purified in a Sepharose-protein G column. By
immunoradiometric assay against the immunogen, the rabbit IgG
anti-salmon Igs showed a high specific titer (at least 1/100.000)
for the antigen. This reagent offers the possibility of detection
of salmon or trout (crossreactivity) humoral immune responses,
both for diagnostic and research purposes.
Key words: polyclonal antibodies,
salmon, diagnosis.
INTRODUCCIÓN
En Chile la década de los 80 representó el
despegue de la producción de salmón de cultivo,
situándose en el segundo lugar a nivel mundial. Las
especies que representan los mayores volúmenes de
producción las constituyen el salmón del
Atlántico (Salmo salar), salmón coho
(Oncorhynchus kisutch) y trucha arco iris (Oncorhynchus
mykiss). Dentro de los principales factores que ayudaron al
desarrollo de
esta industria en
nuestro país destacó, en sus inicios, una ventajosa
situación ictiosanitaria (Méndez y Munita,
1994).
Sin embargo, el éxito
productivo, expresado en un aumento del retorno de divisas, se vio
parcialmente obstaculizado con la aparición de bruscas
mortalidades de salmón coho en el año 1989,
derivadas de
la infección con Piscirickettsia salmonis (Fryer y
col., 1992). Esta última, actualmente, afecta al
salmón del Atlántico, al salmón chinoock
(Oncorhynchus tshawytscha) y trucha arco iris
(Garcés y col., 1991).
Para disminuir el daño
provocado por ésta y otras patologías se han
desarrollado metodologías diagnósticas que apuntan
a la detección del agente causal o de anticuerpos
dirigidos contra éste. Dentro del primer enfoque destacan:
el cultivo de microorganismos en líneas celulares (Wolf y
Quimby, 1962; Fijan y col., 1983; Lannan y col., 1984),
inmunofluorescencia directa o indirecta (Lewis y Allison, 1971;
Lannan y col., 1991) y ensayo inmunoenzimático (ELISA) de
captura del patógeno (Adams, 1992). Empleando el segundo
enfoque: reacciones de aglutinación (Clark y col., 1987),
inmunoprecipitación en geles (Suran y col., 1967),
fijación del complemento (Dorson y Torchy, 1979) y ELISA
(Kaattari y Yui, 1987).
No obstante la ventajosa sensibilidad ofrecida por los
ensayos
inmunométricos, su utilidad se ha
visto restringida por serias dificultades, a nivel mundial, para
la adquisición de anticuerpos contra inmunoglobulinas
(Igs) de salmónidos. No parecería que estas
dificultades se derivaran de problemas en
la purificación del antígeno como se discute
más adelante. Para contribuir al diagnóstico de
diversas patologías, en este trabajo se
describe una combinación de procedimientos
experimentales simples y estándares para la
producción de anticuerpos policlonales anti-Igs de
salmón.
MATERIAL Y MÉTODOS
OBTENCION DE IG DE SALMON
Obtención de suero de
salmón. Un grupo de 10
salmones del Atlántico (Salmo salar) de mar,
adultos, sanos, de aproximadamente 2 kg, fueron anestesiados por
inmersión en una solución acuosa de
benzocaína al 0.001% v/v y sangrados mediante corte
transversal profundo a nivel de las branquias (arterias aorta
ventral y coronaria). Los sueros fueron obtenidos por
procedimientos estándares y congelados a
-20°C.
Purificación de Igs de salmón. De
acuerdo a lo descrito por Havarstein y col. (1988) de los sueros
de salmón se aislaron sus Igs, inicialmente por medio de
precipitación con sulfato de amonio al 50% de
saturación. Las Igs precipitadas fueron primero lavadas
con sulfato de amonio al 50% de saturación y luego
redisueltas en tampón fosfato salino (PBS) para su
posterior diálisis contra PBS, durante toda la noche a
4°C. Posteriormente, este material fue sometido a
cromatografía de exclusión por tamaño
molecular en una columna (120 x 2.5 cm) de Sephacryl S-300,
eluyendo con PBS. La separación cromatográfica fue
monitorizada mediante geles de poliacrilamida en presencia de
dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), seguida de tinción con
azul de Coomassie. Aquellas fracciones que mostraron cadenas
pesadas (H) y livianas (L) fueron
combinadas.
GENERACION DE IGG POLICLONAL ANTI-IG DE
SALMON
Inmunización de conejos. Dos conejos
hembras neozelandesas, de 2 meses de edad fueron inmunizadas con
500 µg de proteína total, por inoculación, de
Ig de salmón purificada (mezcla de fracciones
cromatográficas 29-31). El protocolo
consistió en una primera inoculación
subcutánea de 5 ml (2.5 ml de coadyuvante de Freund
completo y 2.5 ml de solución antigénica suspendida
en suero fisiológico), una segunda subcutánea de
igual volumen (2.5 ml
de coadyuvante de Freund incompleto y 2.5 ml de solución
antigénica) y una última intraperitoneal de 1 ml
(0.5 ml de coadyuvante Freund incompleto y 0.5 ml de
solución antigénica), todas ellas separadas por una
semana. Las sangrías fueron semanalmente, empezando con
una preinmune. Los sueros se obtuvieron mediante procedimientos
estándares.
Purificación por afinidad de IgG de conejo
anti-Ig de salmón. Alícuotas de 5 ml de suero
de conejo (tercera sangría) fueron pasadas a través
de una columna de afinidad de Sefarosa-proteína G. La
columna, con la mayor parte de las IgG retenidas, fue lavada con
100 veces su volumen de PBS. Luego ésta fue eluida con
buffer glicina (glicina 0.1M / NaCl 0.15M, pH 2.6),
colectando el material eluido sobre buffer Tris 2M pH 8.0. La
pureza de la IgG de conejo fue analizada mediante SDS-PAGE,
seguida de tinción con azul de Coomassie.
Titulación de la IgG anti-Ig de
salmón. Pocillos de placas de cloruro de polivinilo
(PVC) fueron sensibilizados con 50 µl de una
solución 20 µg/ml de Ig de salmón purificada.
Los sitios reactivos remanentes se bloquearon con albúmina
sérica bovina al 1% p/v en PBS. Diluciones seriadas de la
IgG anti-Ig de salmón se hicieron reaccionar con la Ig
adsorbida a la fase sólida. El revelado se efectuó
con IgG de cabra anti-IgG de conejo, purificada por afinidad y
radiomarcada con 125I. La radiactividad asociada
específicamente a los pocillos fue medida en un contador
gamma.
Página siguiente  |