Patogenicidad de una colección de cepas nativas de Metarhizium spp. y Beauveria spp. (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

Colecta de insectos

Para los ensayos de
patogenicidad se utilizaron larvas de A. cervinus, y
adultos de O. sulcatus y A. superciliosus. Las
larvas de A. cervinus fueron colectadas desde un huerto de
frambuesas (Rubus idaeus L.) de 4 años, ubicado en
Parral, VIII Región, en los meses de enero y febrero de
1998. Los adultos de O. sulcatus fueron colectados en
febrero de 1998 en un huerto de frambuesas de la localidad de San
Pablo, Osorno, X Región. Adultos de A.
superciliosus se colectaron en enero de 1999 desde un huerto
de frambuesa ubicado en San Carlos, VIII
Región.

Las larvas fueron mantenidas en cajas con tierra
pasteurizada y raicillas de frambuesa desinfectadas. Los adultos
fueron mantenidos en cajas con trozos de polietileno de baja
densidad, y
hojas y tallos de frambuesa lavados. Todos los individuos fueron
mantenidos en una cámara a temperatura
constante de 20ºC.

Origen del inóculo

Los aislamientos de Metarhizium y Beauveria provinieron
de insectos muertos encontrados en terreno y de una colecta de
suelos realizada
a lo largo del país por el Programa de
Control
Biológico del CRI Quilamapu de INIA. Para las muestras de
suelo se
utilizó el método del
cebado (Goettel e Inglis, 1997) con larvas de la polilla de la
cera (Galleria melonella), las que fueron criadas en
confinamiento y dieta artificial. Cinco larvas de último
estadío fueron depositadas en el interior de tubos
plásticos de 5 x 15 cm, junto con la
muestra de
suelo. Luego de 5 días las larvas se extrajeron e
incubaron en cámara húmeda para el desarrollo de
posibles entomopatógenos. Las estructuras
fungosas que se desarrollaron sobre las larvas muertas fueron
cultivadas en placas de Petri de 6 cm de diámetro, con
agar papa dextrosa (APD, DIFCO) y repicadas hasta obtener un
cultivo puro. Luego, cada aislamiento fue traspasado a tubo de
ensayo con APD
y conservado en frío (5°C), además se mantuvo
una contramuestra en nitrógeno líquido
(-196ºC).

La identificación de las cepas se realizó
mediante observaciones macro y microscópicas de la
morfometría de conidias y conidioforos. Estas mediciones
fueron comparadas con claves dicotómicas (Barnett y
Hunter, 1987; Samson et al., 1988; Humber, 1997) para la
identificación de los géneros de hongos. Para la
realización de este trabajo solo
se utilizaron aislamientos identificados de Metarhizium y
Beauveria, ya que otros géneros detectados solo fueron
ocasionales. El origen de las cepas utilizadas para cada insecto
se indica en los Cuadros 1, 2 y 3. La selección
de cepas dependió de la oportunidad de contar con cultivos
homogéneos y en fase de esporulación, al momento en
que estuvo disponible en forma masiva la plaga a evaluar. Lo
anterior significó que no siempre fue posible evaluar
todos los aislamientos, sobre las tres especies de
insectos.

Cuadro
1.
Origen de las cepas, mortalidad, probabilidad de
similitud con el testigo (c 2) y tiempo de
esporulación en adultos de Aegorhinus superciliosus
inoculados con distintas aislaciones de Metarhizium y
Beauveria.
Table 1.
Aegorhinus superciliosus origin and adult mortality after
inoculation with different Metarhizium y Beauveria
isolates, goodness of fit probability (c 2) between each isolate and
the control, and time to sporulation of dead insects.

1 S
(n° de insectos muertos/(n° día x n°
total de insectos)), calculado hasta 6 días después
de la inoculación.
2 Probabilidad de
c 2 para
tabla de contingencia de 2×2 entre el testigo y el respectivo
Indice de Mortalidad.
3 Indica el promedio de
días entre mortalidad y esporulación.
4 Corresponde a praderas
mixtas de gramíneas y tréboles de crecimiento
espontáneo.

Cuadro
2.
Origen de las cepas, mortalidad, probabilidad de similitud con el
testigo (c
2) y tiempo de esporulación
en larvas de Asynonychus cervinus inoculados con distintas
aislaciones de Beauveria spp.
Table 2.
Asynonychus cervinus origin and larvae mortality after
inoculation with different Beauveria isolates,
goodness of fit probability (c 2) between each isolate and the
control, and time to sporulation of dead insects.

1 S
(n° de insectos muertos/(n° día x n°
total de insectos)), calculado hasta 4 días después
de inoculación.
2 Probabilidad de
c 2 para
tabla de contingencia de 2×2 entre el testigo y el respectivo
Indice de Mortalidad.
3 Indica el promedio de
días entre mortalidad y esporulación.
4 Corresponde a praderas
mixtas de gramíneas y tréboles de crecimiento
espontáneo.
5 Corresponde a praderas
sembradas de mezclas de
gramíneas y tréboles.

Cuadro 3.
Origen de las cepas, mortalidad, probabilidad de similitud con el
testigo (c
2) y tiempo de esporulación
en adultos de Otiorhynchus sulcatus inoculados con
distintas aislaciones de Metarhizium.
Table 3.
Otiorhynchus sulcatus origin and adult mortality after
inoculation with different Metarhizium isolates,
goodness of fit probability (c 2) between each isolate and the
control, and time to sporulation of dead insects.

1 S
(n° de insectos muertos/(n° día x n°
total de insectos)), calculado hasta 15 días
después de inoculación.
2 Probabilidad de
c 2 para
tabla de contingencia de 2×2 entre el testigo y el respectivo
Indice de Mortalidad.
3 Indica el promedio de
días entre mortalidad y esporulación.
4 Corresponde a praderas
mixtas de gramíneas y tréboles de crecimiento
espontáneo.

Pruebas de patogenicidad

Para obtener inóculo fresco para las pruebas de
patogenicidad, se sembró cada aislamiento en placas Petri
con APD y se incubó a 25°C por 20 días
aproximadamente, hasta obtener el cubrimiento de la placa con
micelio y conidias. Las conidias fueron aplicadas en seco sobre
los insectos, utilizando para la inoculación de cada
individuo, un
trozo de 10 mm de diámetro de agar colonizado por el
hongo. O. sulcatus fue inoculado con 24 aislamientos de
Metarhizium originarios de la zona Sur y Centro-Sur de
Chile; A. cervinus con 37 aislamientos de Beauveria
de distintas zonas del país, y en A. superciliosus
se evaluaron 10 aislamientos de Metarhizium y 9 de
Beauveria. Las larvas inoculadas fueron mantenidas en
placas con suelo pasteurizado y raíces de frambuesa
desinfectadas, las que fueron cambiadas periódicamente, y
los adultos en placas con hojas lavadas de frambuesa. Se
evaluó cada 24 h la mortalidad de insectos y el momento de
la aparición de signos del
hongo.

El diseño
experimental utilizado fue uno completamente al azar con 5
repeticiones por aislamiento, utilizando un insecto como unidad
experimental. Los resultados obtenidos fueron comparados
calculando el índice de mortalidad para cada aislamiento
(IM), el que corresponde a la sumatoria del número de
insectos muertos cada día (NI), dividido por el producto entre
el número del día (ND) por el número total
de individuos (NT), de acuerdo a la siguiente
fórmula:

IM = å (NI/ (ND x NT))

Este índice buscó favorecer a los
aislamientos que causaron mayor mortalidad en los primeros
días postinoculación, de manera de aumentar la
exigencia para elegir los aislamientos más agresivos. Los
ensayos se evaluaron hasta el momento en que uno de los
aislamientos logró el 100% de mortalidad de insectos.
Todos los aislamientos fueron comparados a través de la
prueba de c
2, evaluando la hipótesis de independencia
de cada índice de mortalidad en relación al
testigo, confrontados en tablas de contingencia de 2×2 (Gomez y
Gomez, 1984).

RESULTADOS Y DISCUSION

Los aislamientos presentaron diferencias en
patogenicidad, de acuerdo al test de c 2, para
las diferentes plagas evaluadas. Para A. superciliosus, 17 de las
19 aislaciones aplicadas causaron mortalidad para esta especie,
siendo M430 originaria de Osorno (X Región) y B306 del
Valle de Chaca (I Región), las que presentaron mayor
índice de mortalidad y fueron diferentes al testigo a
P£ 0,05. El testigo y los aislamientos M146 y B73 no
presentaron mortalidad mientras duró el ensayo
(Cuadro 1 y Figura 1). Luego de algunos días de
incubación en cámara húmeda, se
observó emisión de micelio y posteriormente de
esporas en las zonas menos esclerosadas del tegumento del
insecto, lo que coincide con lo citado por otros autores (Alves y
Pereira, 1998).

Figura
1.
Mortalidad de adultos de Aegorhinus superciliosus
inoculados con distintas aislamientos de Metarhizium spp.
y Beauveria spp.
Figure 1.
Aegorhinus superciliosus adult mortality after inoculation
with different Metarhizium and Beauveria spp.
isolates.

En el caso de A. cervinus, de los 36 aislamientos de
Beauveria evaluados, sólo 24 causaron mortalidad a esta
plaga a los tres días de inoculación, en tanto los
12 aislamientos restantes no provocaron mortalidad de larvas, al
igual que el testigo (Figura 2). Con el aislamiento B179,
originario de Pumanzano, Chiloé (X Región), se
alcanzó el mayor índice de mortalidad y fue
estadísticamente diferente al testigo a P = 0,031 (Cuadro
2). Las larvas muertas por Beauveria adquirieron una consistencia
dura en un principio, para luego de dos días de
incubación observarse los primeros signos del hongo, que
correspondieron a micelio blanquecino que paulatinamente
quedó cubierto de esporas blancas.

Figura
2.
Mortalidad de Asynonychus cervinus inoculados con
distintas aislamientos de Beauveria spp.
Figure 2.
Asynonychus cervinus larvae mortality after inoculation
with different Beauveria spp. isolates.

En O. sulcatus, de los 24 aislamientos de Metarhizium
evaluados, 15 causaron mortalidad y 9 aislamientos más el
testigo fueron inocuos mientras duró el ensayo (Figura 3).
El aislamiento M151b (Río Chamiza, X Región)
produjo un 100% de mortalidad y fue diferente al testigo a P =
0,045 (Cuadro 3). Además, M151b produjo una rápida
emisión de esporas sobre el cuerpo del insecto, lo que es
importante para su posterior diseminación en terreno (Dr.
D. Moore, 1998, comunicación personal). El
bajo número de aislamientos que resultaron
estadísticamente diferentes al testigo se debe al exigente
índice de mortalidad, el cual favorece los aislamientos
que provocan alta mortalidad los primeros días de
postinoculación. La finalidad de este índice fue
obtener el mejor aislamiento para futuras pruebas de
dosificación y eficacia, sin
embargo, se debe tener presente que también existieron
otros aislamientos patogénicos a las diferentes plagas
evaluadas, pero que resultaron mas lentos en causar enfermedad en
los insectos.

Figura
3.
Mortalidad de adultos de Otiorhynchus sulcatus inoculados
con distintos aislamientos de Metarhizium spp.
Figure 3.
Otiorhynchus sulcatus adult mortality after inoculation
with different Metarhizium spp. isolates.

Es importante destacar que los aislamientos que
resultaron patogénicos para alguna especie, no siempre
causaron mortalidad en otra plaga, lo que nos permite sugerir la
existencia de especificidad en las distintas cepas, justificando
la realización de pruebas preliminares y prospecciones en
busca del aislamiento más efectivo para determinada plaga.
La especificidad es una de las características de los
hongos entomopatógenos, la cual es citada como una ventaja
al no dañar organismos benéficos, o desventaja
cuando existen mezclas de especies plagas en el cultivo (Glare,
1992; Tanada y Kaya, 1993; Alves, 1998). Esta
característica es causada por variabilidad en cuanto a la
capacidad de adherencia y/o penetración de la conidia en
el integumento, además de su actividad toxicogénica
(Vey et al., 1982). La primera barrera que opone el insecto a la
penetración del patógeno es la cutícula, la
cual difiere marcadamente entre el estadío larval o el
adulto, por lo cual no necesariamente un buen aislamiento de
entomopatógeno para adulto va a ser igualmente efectivo
para la larva. Este diferencia deberá tenerse presente en
las futuras evaluaciones de susceptibilidad de especies de
insecto.

También llamó la atención la susceptibilidad de las
diferentes plagas evaluadas a aislamientos geográficamente
separados. Por ejemplo, en el caso de A. superciliosus, los dos
aislamientos más patogénicos fueron de Osorno (X
región) y Valle de Chaca (I región), ambas
localidades separadas aproximadamente por 3.000 km. La
especificidad de las cepas puede estar dada por adaptaciones
patológicas al compartir el mismo nicho o, por el
contrario, no haber compartido nunca el mismo ambiente
(Ferron, 1978; Tanada y Kaya, 1993). Lo anterior podría
explicar la alta patogenicidad de cepas geográficamente
aisladas. Por otro lado, ambos géneros poseen un amplio
rango de hospederos, lo cual explica que estos hongos se
encontraran en ambientes tan disimiles, como son las muestras del
Lago Chungará, ubicado en la I Región (B294), y el
aislamiento de Futalelfú en la X Región
(M142).

Tanto Beauveria como Metarhizium pertenecen a la
clase
Hyphomycetes, dentro de la división Deuteromycotina, la
cual se caracteriza por producir sus conidias libres, en lugar de
estar encerradas dentro de un cuerpo fructífero. Esto
permite que las esporas queden inmediatamente disponibles para
repetir el ciclo a partir de los insectos parasitados.
Además, los Hyphomycetes son más productivos, de
ciclos más cortos y relativamente fáciles de
producir en forma masiva, por lo cual no es casualidad que estos
dos géneros sean los más frecuentemente citados y
utilizados en patología de insectos (Ferron, 1978; Glare,
1992; Tanada y Kaya, 1993; Shah, et al., 1997; Alves,
1998).

A pesar que se han detectado con anterioridad este tipo
de hongos en Chile (Dutky, 1957; Vásquez, 1977; France, et
al., 1998; Guerrero y Carrillo, 1998) y se han realizado pruebas
de patogenicidad, no ha existido hasta la fecha una
prospección sistemática. Los antecedentes de uso de
hongos entomopatógenos en Chile muestran resultados no
siempre satisfactorios, debido principalmente a que las cepas
utilizadas fueron colectadas en otros países o no se
realizó una selección previa con varios
aislamientos (Dutky, 1957; Ripa y Rodríguez,
1989).

El desarrollo de este tipo de control biológico
ofrece una alternativa más de control de
plagas, especialmente para el caso de los escarabeidos, los
que han sido considerados como las plagas del futuro (Jackson,
1992). A diferencia de otras familias de insectos, relativamente
pocas especies de hongos son patogénicas a Escarabeidae,
ya que éstos han desarrollado métodos
efectivos para contrarrestar a los entomopatógenos que
habitan en el suelo (Glare, 1992; Tanada y Kaya, 1993). Sin
embargo, los resultados de este trabajo incentivan la
búsqueda de nuevos hongos entomopatógenos en Chile,
de manera de encontrar nuevos y mejores aislamientos para el
control de estas plagas.

CONCLUSIONES

De los resultados obtenidos se concluye que existen
aislamientos nativos de los hongos Beauveria y
Metarhizium con actividad patogénica a
Aegorhinus superciliosus, Asynonychus cervinus y
Otiorhynchus sulcatus. Además, estos hongos
muestran especificidad para las distintas especies de insectos,
lo que obliga a realizar pruebas de patogenicidad con numerosas
cepas, antes de seleccionar la más agresiva. En laboratorio,
los mejores aislamientos muestran un alto potencial de control de
los insectos evaluados, sin embargo se requiere evaluar su
efectividad en terreno.

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