Guía de trabajo práctico para estudiantes de segundo año de la carrera de medicina (página 2)
17. No abandonar el laboratorio sin la debida
autorización del profesor.18. El incumplimiento de alguno de los aspectos
relacionados, se considera una indisciplina.
Práctica de
Laboratorio No. 1
Tema 2: Parasitología
Médica
Título: Diagnóstico de laboratorio de
protozoos
intestinales y sanguíneos.
Objetivos:
Enumerar los diferentes productos patológicos
que se requieren para el diagnóstico de los protozoos
intestinales y sanguíneos.Mencionar las características que deben
cumplir las diferentes muestras para el diagnóstico de
protozoos intestinales y sanguíneos, así como
los métodos diagnósticos empleados en cada
caso.Observar al microscopio quistes de protozoos
intestinales y formas parasitarias de
Plasmodium.
Aspectos teóricos
Las enfermedades asociadas a
protozoos tienen en la actualidad una elevada incidencia en la
población mundial algunas de ellas
acompañadas de una alta tasa de mortalidad, tal es el caso
del paludismo y la
tripanosomiasis africana, entre otras. Algunos protozoos
intestinales como Giardia lamblia y Entamoeba
histolytica son causa de mal nutrición,
pérdida de peso y diarreas
severas; otros, como Plasmodium sp, Trypanosoma sp y
Leishmania producen afecciones cardíacas y del SNC,
dañan las membranas mucosas, la piel y
diferentes órganos de la economía.
Los ciclos de vida de los protozoos son muy variados y
complejos. El
conocimiento de éstos permite realizar una toma de la
muestra en el
momento adecuado con el fin de poder observar
el agente biológico y con ello realizar el
diagnóstico certero de la enfermedad. Demostrar e
identificar el agente infectante se considera la regla de
oro en el
diagnóstico parasitológico.
Diagnóstico de los protozoos
sanguíneos.
Dentro de los protozoos sanguíneos se destacan
por su incidencia e importancia epidemiológica
Plasmodium sp, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei y
Leishmania donovanii.
a) Toma de la muestra: Es necesario tener en
cuenta el período en el cual el parásito de
acuerdo a su ciclo de vida, transita por la sangre
(parasitemia) o se encuentra presente en determinados
órganos y/o tejidos (sitios de inoculación) en
los que produce lesiones características. Atendiendo a
ello las muestras pueden ser:
Sangre periférica
Tejidos
LCR
Exudado de las lesiones
Aspirado del chancro inicial o del ganglio
linfático
b) Métodos de
diagnóstico: Pueden ser indirectos o directos. Los
primeros se basan en la determinación de la respuesta
inmune del organismo ante la infección parasitaria a
través de pruebas
inmunoserológicas y los directos se sustentan en la
observación de las formas parasitarias. Los
métodos directos son los más empleados. Estos
pueden ser:
Examen en fresco de la sangre: se coloca una gota de
sangre entre cubre y portaobjetos y se observa al microscopio
con objetivo seco de 40x.Frotis de la sangre: se extiende una gota de sangre
sobre un portaobjeto, se seca al aire y se fija con metanol.
Teñimos por el método de Giemsa y observamos al
microscopio con objetivo de inmersión
(100x).Gota gruesa: se extiende una gota de sangre en un
área del portaobjeto de 1cm2, se deja secar, se
tiñe por el método de Giemsa y se observa al
microscopio con objetivo de inmersión
(100x).
Los métodos indirectos más utilizados son:
ELISA, Inmunofluorescencia, Inmunoprecipitación,
Fijación del complemento y Aglutinación.
Diagnóstico de protozoos intestinales:
Dentro de los protozoos intestinales se destacan por su
interés
clínico Entamoeba histolytica y Giardia
lamblia.
a) Toma de la muestra: La muestra ideal son las
heces las que deben ser colectadas preferiblemente en un
recipiente de cristal o plástico correctamente lavado
y seco. Deben ser además frescas (recién
emitidas) y procesadas rápidamente en particular
cuando queremos observar los trofozoítos de estos
parásitos. De no ser posible el procesamiento
inmediato se deben conservar por diferentes medios que pueden
ser: refrigeración a 4oC, en formol al 5 ó 10
%, alcohol polivinílico (PVA) ó en una
solución de Mertiolato-yodo-formol (MIF). La muestra
debe ser recogida directamente sobre un papel limpio colocado
en el suelo para evitar que se mezcle con la orina ya que las
sustancias aquí presentes pueden dañar los
trofozoítos. En los parasitismos es común que
no se excreten constantemente las formas parasitarias, este
fenómeno está estrechamente relacionado con el
ciclo de vida del parásito y se conoce como fase de
excreción negativa, por tal motivo se recomienda
siempre indicar de tres a seis exámenes de heces con
un periodo de dos a tres días entre uno y otro
(exámenes seriados). En los casos de alta sospecha
clínica de giardiosis se puede obtener también
una muestra de aspirado duodenal o de biopsia duodenal para
realizar el diagnóstico, siempre que los
análisis de las heces hayan resultado
negativos.b) Métodos de
diagnóstico:
Examen directo entre cubre y portaobjeto: Se coloca
una pequeña porción de las heces en un
portaobjeto mezclada con una gota de eosina, lugol o
solución salina fisiológica, se coloca sobre la
preparación una lámina cubreobjeto y se examina
al microscopio con objetivo de 40x.Métodos de concentración: Aumentan
considerablemente la sensibilidad del diagnóstico.
Utiliza una mayor cantidad de muestra (1 gramo
aproximadamente) y se basan en la diferencia que pueda
existir entre el peso específico de la sustancia en la
cual se disuelve la muestra y las formas parasitarias. Basado
en ello se han diseñado diferentes métodos,
dentro de ellos el de Ritchie (solución
formol-éter/acetato de etilo) es el más
utilizado para el diagnóstico de los protozoos y por
el cual se obtiene un concentrado de los quistes por un
proceso de sedimentación.Métodos indirectos: Los más utilizados
son ELISA y aglutinación.
Problema: Usted tendrá en su puesto de
trabajo un
extendido de sangre
teñido con Giemsa con formas parasitarias de Plasmodium
sp., así como diferentes muestras de heces conservadas en
formol que contienen quistes de protozoarios. Realizará el
montaje para el exámen directo de las heces y
observará al microscopio las
diferentes formas parasitarias.
Reactivos y Materiales
Frotis de sangre periférica teñido con
Giemsa.Láminas portaobjetos y
cubreobjetosMicroscopio óptico
Muestras de heces conservadas en formol
Aplicadores
Guantes
Lugol
Procedimiento
Para el exámen de las heces: (Guarde las medidas
adecuadas de bioseguridad, colóquese los guantes antes de
proceder)
a) Coloque en la lámina portaobjeto una
gota de reactivo de lugol.b) Con un aplicador tome una pequeña
porción de heces y mezclela con la gota de lugol en el
portaobjetos haciendo un pequeño círculo.
(Utilice una lámina para cada muestra)c) Coloque encima una lámina
cubreobjetos.d) Lleve la lámina al microscopio
óptico y enfoque con objetivo de 10x. Al lograr una
imagen nítida, pase al objetivo de 40x.e) Observe detenidamente las
características de los quistes observados y realice en
su cuaderno un esquema de las diferentes formas
parasitarias.
Para observar la lámina de sangre
periférica:
a) Adicione sobre la preparación una
gota de aceite de cedro.b) Enfoque con objetivo de inmersión
100xc) Realice en su cuaderno un esquema de las
características de las formas de Plasmodium
observadas.
Presentación de los resultados
– Realice un informe escrito
de lo observado en cada una de las preparaciones.
Autopreparación
Consulte en su libro de
texto,
Microbiología y Parasitología
Médica Tomo III, los siguientes
capítulos:
Capítulo 76, Generalidades, los tema: Ciclo
evolutivo, Proceso infeccioso parasitario, Fuentes de
infección, Vías de entrada al hospedero y
Diagnóstico clínico y de laboratorio de las
enfermedades parasitarias (páginas 9, 11,12, 16 y
17)Capítulo 78, Giardia lamblia
(páginas 31-35)Capítulo 84, Ameba (páginas
107-109)Capítulo 88, Plasmodium
(páginas 151-153 y 159-160)
Después proceda a responder las siguientes
preguntas:
1. ¿Cuáles son las formas
infectantes de Giardia lamblia y Entamoeba
histolytica y cuáles son sus
características más sobresalientes?2. ¿Qué requisitos deben cumplir
las muestras de heces para estudio parasitológico y en
particular para la búsqueda de protozoos intestinales?
¿Qué otra muestra puede ser útil para el
diagnóstico de la giardiosis?3. Ante un paciente con sospecha clínica
de paludismo, ¿Qué examen usted
indicaría? ¿qué muestra sería
necesaria para el estudio? Basado en el ciclo de vida de este
parásito, ¿qué formas parasitarias
pudiera encontrar en dicha muestra?4. En un paciente con un cuadro de diarrea
aguda en el que sospecha una amebiasis, resultó
negativo el primer examen de las heces. ¿Considera
usted este resultado concluyente? Fundamente su
respuesta.
Práctica de
Laboratorio No: 2
Tema 2: Parasitología
Médica
Título: Diagnóstico de helmintos
intestinales
Objetivos:
Mencionar los requisitos que debe cumplir la muestra
de heces para el diagnóstico de infecciones por
helmintos intestinales y los métodos de
diagnóstico más frecuentemente
empleados.Observar al microscopio huevos y larvas de
helmintos.Observar las características
macroscópicas de formas adultas de
helmintos.
Aspectos teóricos.
Las helmintiasis afectan a una gran parte de la
población mundial, en particular a aquellas personas que
no guardan las condiciones higiénico sanitarias adecuadas;
la defecación al aire libre, la
ingestión de agua no
potable para el consumo y de
alimentos
contaminados con tierra, el no
lavado o el lavado incorrecto de las manos antes de ingerir
alimentos, entre otras, constituyen muchas de las causas por las
cuales las personas se infectan con estos
parásitos.
Tal y como ocurre con los protozoos, los helmintos
también poseen ciclos de vida variados y complejos y su
conocimiento
es importante toda vez que permite establecer las pautas tanto
para el diagnóstico de laboratorio como para la
prevención de estas enfermedades.
En los helmintos podemos observar tres formas
parasitarias diferentes: el adulto, el huevo y la larva. Los
helmintos adultos, de forma general, tienen una talla que permite
ser observados a simple vista, sin embargo los huevos y las
larvas son microscópicas. Por tal motivo, el
diagnóstico de laboratorio en estos casos se basa tanto en
la observación macroscópica de las muestras
buscando las formas adultas del parásito, como en la
observación microscópica en la búsqueda de
huevos y larvas.
Diagnóstico de laboratorio
a) Toma de la muestra: La muestra generalmente
son las heces y los requisitos para su obtención y
conservación son los mismos que para el
diagnóstico de los protozoarios. A diferencias de las
infecciones por protozoarios, en estos parasitismos la
diarrea no es un síntoma clínico común
por lo que a veces a determinados pacientes se les hace
difícil obtener la muestra. Es importante en estos
casos aclarar que la muestra siempre debe ser obtenida por
defecación espontánea ya que la
utilización de laxantes y/o lavados intestinales
incrementa el volumen de líquido y con ello la
dilución de las formas parasitarias que puedan estar
presentes en ella. Para el diagnóstico
específico de Fasciola hepática,
Ancylostoma duodenalis, Necator americanus y Strongyloides
stercoralis la muestra de aspirado duodenal
también puede ser útil en la búsqueda de
huevos del parásito cuando los seriados de heces son
negativos.b) Métodos de diagnóstico: Al
igual que para protozoos los métodos pueden ser
directos e indirectos, siendo los directos los más
recomendados.
Exámen directo entre cubre y portaobjeto: se
coloca una pequeña porción de las heces en un
portaobjeto mezclada con una gota de eosina, lugol o
solución salina fisiológica, se coloca sobre la
preparación una lámina cubreobjeto y se examina
al microscopio con objetivo de 40x buscando huevos y
larvas.Métodos de concentración:
Método de Ritchie (ver clase práctica
1)La Copa Cónica: está basado en la
sedimentación y es el más utilizado para el
diagnóstico de Fasciola dado el gran
tamaño y peso de estos huevos.Método de Faust: es una técnica basada
en la flotación que emplea sulfato de zinc.Método de Sheather: es un método
común basado en la flotación que emplea una
solución sobresaturada de azúcar, sal y
formol.
Tamizaje de la heces: Consiste en hacer pasar las
heces por un tamiz (colador) para observar parásitos
adultos o fragmentos de ellos. Auxiliados con una lupa
podemos identificar el agente por sus características
macroscópicas.Método de Graham o de la cinta adhesiva: Es
un método especial para la identificación de
huevos de Enterobius vermicularis, (también
puede ser útil en el diagnóstico de Taenia
sp). Consiste en aplicar un fragmento de cinta adhesiva
transparente en la zona perianal del paciente, se retira y
luego se coloca sobre una lámina portaobjeto para
observar al microscopio los huevos
característicos.Método de Harada-Mori: Es una técnica
empleada para el cultivo de larvas de nemátodos de
interés clínico. Es un método
útil para la diferenciación de ancylostomideos
cuyos huevos son idénticos y es indispensable para el
diagnóstico y seguimiento de las infecciones por
Strongyloides stercoralis.Método de la tinta china: Permite la
diferenciación de las especies de Taenia a
través del conteo de las ramas uterinas de los
proglótides.
Problema: Usted encontrará en su
puesto de trabajo diferentes vidrios reloj que contienen formas
adultas de helmintos para la observación y descripción de sus características
macroscópicas. Asimismo encontrará diferentes
muestras de heces conservadas en formol las que contienen huevos
y larvas de parásitos, procederá al montaje de las
heces por examen directo y la observación posterior al
microscopio.
Reactivos y materiales:
Guantes
Láminas portaobjetos
Láminas cubreobjetos
Aplicadores
Reactivo de Lugol.
Vidrios reloj con parásitos
adultos.Muestras de heces conservadas en formol
Procedimiento:
– Exámen directo de las heces:
a) Proceda de la misma forma que en la
práctica anterior (Diagnóstico de protozoos
intestinales) Recuerde guardar las medidas de bioseguridad
requeridas, colóquese los guantes antes de comenzar a
trabajar.b) Observe detenidamente las
características de los huevos y larvas. Realice un
esquema de lo observado en su cuaderno relacionando cada uno
de ellos con el parásito correspondiente
– Parásitos adultos:
a) Observe detenidamente los parásitos
adultos contenidos en cada vidrio reloj y detalle cada una de
sus características.b) Realice las siguientes anotaciones en su
cuaderno de trabajo: clasificación (si es Nematelminto
o Platelminto y en este último caso si es Cestode o
Trematodo), tamaño aproximado, diferencias entre
hembra y macho, otras características
distintivas.
Presentación de los resultados:
Confeccione un informe que recoja las observaciones
macroscópicas y microscópicas
realizadas.
Autopreparación:
Consulte en su libro de texto, Microbiología y
Parasitología Médica Tomo III, los Capítulos
siguientes:
Capítulo 95, Ascaris, (página
211-214)Capítulo 96 Trichuris (página
217-219)Capítulo 97 Acylostomas y Necator
(páginas 221-224)Capítulo 98 Strongyloides
(página 229-231)Capítulo 100 Enterobius
(páginas 243-245)Capítulo 112 Taenia saginata y Taenia
solium (páginas 331-335Capítulo 121 Fasciola (página
381-383 y 385)
Proceda luego a responder las siguientes
preguntas:
1. Plantee las diferencias morfológicas
fundamentales entre nematodos, cestodes y
trematodos2. ¿Cuál es el nematodo
intestinal de mayor tamaño? ¿Cómo usted
reconocería a simple vista la hembra de este
parásito? ¿Qué características
distintivas tienen sus huevos?3. ¿Qué diferencias presentan las
formas adultas de la hembra y el macho de Trichuris
trichiura que permiten su reconocimiento?
¿Qué características tienen sus
huevos?4. ¿Para qué se utiliza el
método de Graham?5. ¿Qué características
poseen los huevos de Enterobius
vermicularis?6. ¿Por que es necesario la
tinción con tinta china de los proglótides,
para la diferenciación entre T. solium y
T. saginata?7. En un paciente infectado por Fasciola
hepática ¿qué forma parasitaria
usted espera encontrar en las heces?, ¿qué
características fundamentales poseen los huevos de
este parásito?
Práctica de
laboratorio 3
Tema 3: Bacteriología
médica
Microscopía y coloraciones. Cultivo de los
microorganismos.
Objetivos:
Realizar tinción de preparaciones por los
métodos de Gram y Ziehl Neelsen.Identificar al microscopio diferentes
morfologías bacterianas y sus características
tintoriales.Observar las características del crecimiento
bacteriano en diferentes medios de cultivo
Aspectos teóricos
Durante el transcurso de una investigación bacteriológica la
definición de la morfología
y las características tintoriales de un microorganismo
constituyen elementos claves para su identificación y el
punto de partida para la realización posterior de pruebas
fisiológicas y bioquímicas indispensables para la
clasificación definitiva en género y
especie.
El trabajo con microorganismos en el laboratorio se
realiza en condiciones asépticas, tanto para evitar
la
contaminación de la muestra con los microorganismos
ambientales como del investigador con la muestra. Es por esto que
es necesario trabajar siempre en el entorno de la llama de un
mechero bunzen, en un cuarto climatizado (cuarto de siembra) y en
determinadas actividades bajo la protección de un gabinete
de seguridad o flujo
laminar.
Definición de las características
morfológicas y tintoriales: Para definir las
características morfológicas y tintoriales de una
bacteria presente en una muestra lo primero es la
preparación del frotis y la tinción posterior con
colorantes apropiados.
Una de las técnicas
de tinción más empleadas en Bacteriología es
la Tinción de Gram. Este método,
descrito por Christiam Gram en el año 1884, permite
dividir a las bacterias en
dos grandes grupos
(grampositivas y gramnegativas). Utiliza dos colorantes
básicos (violeta cristal y safranina) una solución
mordiente encargada de fijar el colorante violeta (lugol) y una
solución decolorante (alcohol al
70%). Las bacterias Gram positivas retienen el colorante violeta
cristal, por lo que se observan teñidas de color violeta,
mientras que las gramnegativas se decoloran por la acción
del alcohol y toman el segundo colorante (safranina) por lo que
se ven de color rosado.
El fundamento de este método, se consideró
hasta hace pocos años, estaba basado en la diferencia en
la composición química de la pared
celular de ambos grupos bacterianos, sin embargo, estudios
más recientes han demostrado la participación de
proteínas citoplasmáticas en esta
respuesta.
Algunas bacterias no son capaces de teñirse por
el método de Gram, para estos casos se utilizan
métodos de tinción especiales. Uno de los
más utilizados es el de Ziehl Neelsen para la
identificación de micobacterias. Esta es una
tinción diferencial que utiliza la fucsina fenicada como
primer colorante, alcohol ácido como solución
decolorante y el azul de metileno como colorante de contraste.
Los géneros Mycobacterium, Nocardia y algunos
actinomicetos resisten la decoloración por el alcohol
ácido y permanecen teñidos con el primer colorante
(rojo). Es por esto que se conocen como bacilos ácido
alcohol resistente (BAAR). El principio de este método se
basa en la alta proporción de ácidos
micólicos (lípidos)
presentes en la pared celular de estos microorganismos que los
hace resistentes a la decoloración una vez teñidos
por la fucsina. El resto de las bacterias sí se decoloran
y se tiñen con el segundo colorante observándose de
color azul.
Cultivo de los microorganismos: Los medios de
cultivo son soluciones
acuosas de diferentes sustancias nutritivas, necesarias para el
crecimiento y la reproducción de los microorganismos. Estos
son clasificados:
Según su estado físico en:
líquidos, sólidos o semisólidos. La
solidez de los medios se consigue por la adición de
agar. El agar es una sustancia inerte, es decir, no es un
nutriente ni tampoco interfiere con otros constituyentes del
medio de cultivo.Según su finalidad los medios se clasifican
en:
Generales o universales: Garantizan el crecimiento
de un elevado número de microorganismos. Ej. Agar
nutriente, Agar sangre, Caldo cerebro–corazón,
etc.Enriquecimiento: Son medios complejos con aditivos
adicionales para favorecer el crecimiento de determinados
microorganismos (particularmente exigentes). Ej. Caldo
selenito, Caldo tetrationato de sodio, etc.Selectivo: Son aquellos que favorecen por su
diseño el crecimiento específico de un
microorganismo (o grupo de microorganismos). Es de gran
utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de
una población microbiana mixta. Ej. Agar SS, Agar Mc
Conkey, Agar TCBSDiferencial: Destinados a facilitar la
discriminación de microorganismos de una mezcla por
sus propiedades diferenciales del crecimiento en dichos
medios.
Instrumentos de siembra: Los instrumentos empleados
son:
Asa de alambre
Aguja de alambre
Hisopo
Pipeta
Espátula de Drigalsky
Jeringuilla
Métodos de siembra: La siembra de acuerdo a los
propósitos, el instrumento utilizado y las
características del medio donde se va a realizar el
cultivo puede realizarse por:
Diseminación: se realiza de diferentes formas
y con instrumentos variados dependiendo del objetivo que se
persiga. Ejemplo: para obtener colonias aisladas en un medio
de cultivo sólido se utiliza la diseminación
por estrías, para lo que se emplea el asa de alambre.
(Fig. 3.1)- Picadura: se realiza con aguja de alambre,
fundamentalmente en medios sólidos o semisólidos
contenidos en tubos de cultivo.
A profundidad: También conocido como placa
vertida. Es un método de siembra especial donde por lo
regular el inóculo se mezcla con el medio de cultivo.
(Fig. 3.2)
Incubación: Los medios de cultivo sembrados se
colocan en incubadoras a la temperatura,
humedad y concentración de oxígeno
óptimas para el crecimiento. Las condiciones de
incubación dependen de las características y del
tiempo de
generación del microorganismo. Las bacterias que
comúnmente parasitan al hombre se
desarrollan bien a temperaturas entre 35 y 37 oC en
períodos de 18 a 24 horas.
Observación del crecimiento: Después de la
incubación se observan las características del
crecimiento del microorganismo y los cambios ocurridos en el
medio de cultivo. En medios de cultivo en placas Petri pueden ser
apreciados los caracteres de las colonias microbianas: color,
borde (entero o festonado) brillo, superficie (lisa o rugosa)
tamaño y producción de lisis de los glóbulos
(éste último solo si el medio de cultivo empleado
fuera Agar Sangre).
Problema: usted encontrará en su
puesto de trabajo placas con cultivo bacteriano los que
deberán identificar morfológicamente por la
técnica de Gram definiendo forma, modo de
agrupación y carácter tintorial del microorganismo,
describirá además las características
más sobresalientes observadas en los cultivos.
Encontrará frotis elaborados a partir de una muestra de
esputo para realizar tinción de Ziehl
Neelsen.
Reactivos y materiales.
Asa de siembra
Portaobjetos
Colorantes para la tinción de Gram
Colorantes para la tinción de Ziehl
NeelsenPreparaciones para teñir por Ziehl
NeelsenMechero bunzen
Aceite de cedro
Agua destilada estéril
Placas y tubos con cultivos.
Procedimiento.
Preparación del frotis a partir del
cultivo:
1. Coloque sobre la lámina portaobjeto una gota
de agua destilada estéril.
2. Esterilice el asa de siembra a la llama del mechero.
(Fig. 3.3)
3. Arrastre una pequeña porción del
cultivo bacteriano con el asa en condiciones
asépticas.
4. Suspenda las células en
la gota de agua sobre el portaobjeto.
5. Deje secar al aire.
6. Fije la preparación cortando con la
lámina tres veces la llama del mechero (Fig.
3.4).
Tinción de Gram
Cubra el frotis con cristal violeta al 1%, espere 30
segundos y lave con agua corriente.Cubra el frotis con lugol, espere 30 segundos y lave
con agua corriente.Cubra el frotis con alcohol etílico o alcohol
acetona, espere 30 segundos y lave con agua
corrienteCubra el frotis con el colorante safranina, espere
30 segundos y lave con agua corriente.Secar al aire.
Adicione una gota de aceite de cedro sobre la
preparación y observe al microscopio con el objetivo
de mayor aumento (100X).Realice un esquema en su cuaderno de lo observado y
anote las características morfológicas y
tintoriales del microorganismo problema.
Tinción de Ziehl Neelsen
Cubra el frotis con fucsina y caliente el colorante
sobre la lámina dándole calor a la
lámina por debajo hasta que se observe la
emisión de vapores. Espere 5 minutos y lave con
abundante agua corriente.Cubra la lámina con alcohol-ácido,
espere 2 minutos y lave con agua corriente.Cubra la preparación con azul de metileno,
espere 30 segundos y lave con agua corriente.Secar al aire.
Coloque sobre la preparación una gota de
aceite de cedro y observe al microscopio con objetivo de
inmersión (100X).Anote en su cuaderno los resultados de la
observación.
Definición de características
culturales
Observe detenidamente los cultivos en las placas y
determine las diferentes características de las
colonias: tamaño, color, borde, superficie, aspecto,
producción de hemólisis, etc.Anote los resultados de lo observado en su cuaderno
de trabajo
Presentación de los resultados:
Prepare un informe con los resultados obtenidos del
trabajo realizado en el laboratorio de acuerdo a las indicaciones
de su profesor.
Autopreparación
Revise en su libro de texto, Microbiología y
Parasitología Médica Tomo I, los capítulos
que a continuación se relacionan:
Capítulo 4, Microscopía y coloraciones
(Pág. 20-28)Capítulo 5, Características de las
células procarióticas y eucarióticas
(Pág. 29-36)Capítulo 7 Cultivo y crecimiento de los
microorganismos (Pág. 45-54)
Proceda después a responder las siguientes
preguntas:
1. La coloración de Gram es una de las
más utilizadas en Bacteriología, ¿en
qué se fundamenta este método?2. La tinción de Ziehl Neelsen se
utiliza para la observación al microscopio de las
micobacterias. ¿Cuál es el fundamento de este
método de tinción?, ¿considera usted que
si se omitiera el paso del calentamiento de la fucsina sobre
la lámina, se obtendrían los mismos resultados?
Fundamente.3. ¿Qué se conoce como cultivo o
siembra en Bacteriología? Cite ejemplos de medios de
cultivo generales, diferenciales, selectivos y de
enriquecimiento.4. El agar es una sustancia inerte que aporta
solidez a los medios de cultivo permitiendo el desarrollo de
colonias aisladas. ¿Qué ventajas representa
esto para el diagnóstico?5. La tinción negativa es uno de los
métodos empleados en el laboratorio de
microbiología. Al respecto diga: ¿qué
tipo de colorantes usted utilizaría en este caso?,
¿qué diferencias tiene este método con
un método de tinción simple?
Clase práctica
No 4
Tema III Bacteriología
Médica
Título: Quimioterapia antimicrobiana.
Métodos de respaldo al tratamiento
antimicrobiano.
Objetivos:
Interpretar los mecanismos de acción de las
drogas antimicrobianas y los mecanismos de resistencia
desarrollados por las bacterias para contrarrestar su
efecto.Interpretar los resultados de un antibiograma por
métodos de difusión y dilución de
acuerdo a las categorías de susceptibilidad
establecidas.
Aspectos teóricos
El descubrimiento de los antibióticos en el
pasado siglo dio inicio a una nueva era en el tratamiento de las
enfermedades infecciosas que estuvo marcada en la década
de los años 20 por la obtención de la penicilina a
cargo del notable científico Sir Alexander Fleming. La
introducción de este antibiótico por
primera vez en la clínica a inicios de la década
del 40 y los subsiguientes descubrimientos de otras drogas con
mecanismos y espectro de acción variados, permitió
ganar una de las más importantes batallas libradas por
el hombre en
la lucha por la supervivencia.
Prácticamente desde los inicios en el uso de las
entonces consideradas "drogas milagrosas" se evidenció la
capacidad que tenían los microorganismos tanto para
desarrollar mecanismos capaces de contrarrestar el efecto de
estos fármacos, como de trasmitir tal
característica a otros miembros de su progenie. Los
mecanismos de resistencia
desarrollados por las bacterias están estrechamente
relacionados con el "blanco"o estructura de
la
célula sobre la que actúa un antibiótico
o grupos de antibióticos en específico.
En la actualidad existen en uso más de un
centenar de drogas pertenecientes a diferentes grupos y
generaciones de antimicrobianos con capacidad variada para
inhibir y matar microorganismos. Los mecanismos de acción
de estos fármacos se agrupan generalmente en los
siguientes:
1) Los que inhiben la síntesis de la
pared celular2) Los que inhiben la función de la
membrana celular3) Los que inhiben la síntesis
proteica4) Los que inhiben la síntesis de los
ácidos nucleicos
Inhibición de la síntesis
de la pared celular: Los antibióticos que actúan
afectando la pared celular, tienen la capacidad de unirse a
proteínas de la membrana citoplasmática bacteriana
conocidas como PBP, siglas provenientes del inglés
"penicilin binding protein" o lo que es lo mismo,
proteínas de unión a penicilina. Estas, en su
mayoría transpeptidasas, son las encargadas de transportar
las pequeñas cadenas peptídicas que junto a las
subunidades repetidas de N-acetilglucosamina y
N-acetilmurámico conforman la estructura de enrejado
característico del peptidoglucano, sustancia que aporta
rigidez a la pared de la bacteria y que le permite garantizar su
forma e integridad celular. La unión de la penicilina a
esta enzima por su centro activo, impedirá a la
transpeptidasa cumplir su función;
como consecuencia se debilita la pared y la bacteria muere por
lisis celular. Ejemplos de antibióticos que actúan
por esta vía son todos los pertenecientes al grupo de los
ÃY-lactámicos (antibióticos que se
caracterizan por presentar en su estructura química un
anillo ÃY-lactámico) que son los más
abundantes y utilizados en la clínica. Entre los
más conocidos podemos citar las penicilinas y todos sus
derivados, además de otros como el ceporán,
cefazolina y ceftriaxone, representantes de las
cefalosporinas.
Inhibición de la función de la membrana
celular: Los antibióticos que actúan a este nivel
realizan función de detergentes o surfactantes, estos
compuestos se adosan a la superficie externa de la membrana
celular alterando su estructura y propiedades osmóticas.
La unión de estos compuestos a la membrana se cree
producen una reorientación de la estructura de mosaico
fluido característico. Actúan por esta vía
las polimixinas y los antifúngicos,
fundamentalmente.
Inhibición de la síntesis proteica: Los
fármacos que actúan impidiendo esta función
tienen la capacidad de interactuar con el ribosoma bacteriano de
forma selectiva en alguno de los eventos que
ocurren a nivel de las subunidades 30S y/o 50S, interfiriendo de
algún modo en la fidelidad de la lectura del
código
genético o por interferencia directa en alguno de los
procesos de la
síntesis proteica propiamente dicha. Una variedad de
antibióticos actúan de esta forma entre los que se
encuentran el cloramfenicol, la eritromicina, tetraciclina,
kanamicina y gentamicina, entre otros.
Inhibición de la síntesis de los
ácidos nucleicos: Por este mecanismo los
antibióticos actúan alterando la estructura
organizada de doble hélice del ADN bacteriano
por bloqueo de la enzima ADN gyrasa o Topoisomerasa II
afectándose el proceso de
replicación y posteriores eventos de transcripción
y traducción para la síntesis
proteica. Ejemplos de antibióticos que actúan a
este nivel son las quinolonas representadas por el ácido
nalidíxico y la ciprofloxacina, entre otros así
como también la rifampicina.
Mecanismos de resistencia de las bacterias a los agentes
antimicrobianos.
Se plantea que la resistencia de las bacterias a los
antibióticos puede tener dos orígenes, uno
genético y otro no genético. El no genético
está relacionado con la aparición de resistencia
debido a la pérdida del blanco de acción de una
droga
específica en la bacteria o por un proceso de
inactivación (no multiplicación) que sufren algunas
especies en determinados tejidos que
infectan. Por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis
tiene la capacidad de sobrevivir en los tejidos durante
años sin multiplicarse después de causar un proceso
infeccioso tiempo durante el cual se hace resistente al
tratamiento. En cualquiera de estos casos la resistencia al
fármaco no se transfiere a otras generaciones celulares y
la susceptibilidad se recupera tan pronto el microorganismo
comience nuevamente a multiplicarse o recupere la estructura
perdida.
El mecanismo de resistencia genético, por su
carácter heredable y transmisible horizontalmente incluso
entre diferentes poblaciones microbianas, es el más
importante y es el que desarrolla la bacteria como respuesta al
ataque del agente antimicrobiano. Puede ser:
Cromosómico: cuando se produce una
mutación en un locus que controla dentro del genoma la
susceptibilidad a un medicamento dado.Extracromosómico: cuando en el intervienen
elementos no cromosomales conocidos como plásmidos los
que pueden ser íntegramente transmitidos de una
bacteria a otra por los diferentes procesos de intercambio
genético (conjugación, transducción y
transformación). De este modo la adquisición de
uno solo de estos plásmidos R (plásmidos de
resistencia) codifica en la bacteria resistencia para tantos
antibióticos como información contenida tenga
cada uno de ellos. Los transposones son pequeños
segmentos de plásmidos R con capacidad de insertarse
en cualquier sitio del genoma (mecanismo de
transposición) que también codifican
resistencia específica a diferentes
fármacos.
Los mecanismos genéticos de resistencia a los
antimicrobianos más comunes son los siguientes:
1. Inactivación
enzimática2. Modificación estructural del blanco o
sitio de acción3. Disminución de la permeabilidad a la
droga4. Desarrollo de bombas de eflujo
activo
Inactivación enzimática: Es el más
común. Las enzimas
más conocidas son las denominadas ÃY-lactamasas
desarrolladas por bacterias grampositivas y gramnegativas para
inactivar a los antibióticos del tipo
ÃY-lactámicos. La enzima es capaz de actuar sobre
el antibiótico antes de que éste se una a las PBP
que constituyen su blanco de acción Del mismo modo que son
estos los antibióticos más utilizados en la
clínica, en correspondencia con ello ya se han
identificado más de 300 enzimas ÃY-lactamasas, que
se diferencian en su perfil bioquímico y están
destinadas a la hidrólisis de diferentes
sustratos.
Modificaciones estructurales en los blancos o sitios de
acción: La bacteria desarrolla un blanco estructural
alterado incapaz de ser reconocido por el antibiótico
específico. Ej. las bacterias resistentes a la oxacilina
(penicilina capaz de resistir el efecto de las enzimas
ÃY-lactamasas) eluden el efecto del antibiótico
produciendo una modificación estructural de su blanco que
son las PBP.
Disminución de la permeabilidad a la droga: Ante
el ataque de determinados fármacos las bacterias pueden
evadirlo por modificaciones en la permeabilidad de la membrana al
medicamento. Por ejemplo, pérdida de poros de membrana
especializados en el transporte de
determinadas sustancias.
Desarrollo de bombas de eflujo
activo: Diferentes microorganismos han creado esta defensa ante
el ataque de un gran diversidad de fármacos. Producen
proteínas especializadas en extraer el antibiótico
del interior de la célula una
vez que ha penetrado en el espacio periplásmico. Este
mecanismo es extremadamente eficiente dado que la velocidad con
que la bacteria saca de su interior el antibiótico es
mayor que la velocidad con que éste penetra.
Resistencia cruzada: Cuando determinadas bacterias
presentan resistencia a varios antibióticos que comparten
parcial o totalmente un mismo mecanismo de acción, se dice
entonces que existe resistencia cruzada.
Pruebas de susceptibilidad a los
antimicrobianos.
Tan pronto como fue introducido en la práctica
clínica el uso de los antibióticos, surgió
también la necesidad de implementar métodos de
laboratorio capaces de medir el grado de efectividad de las
diferentes drogas empleadas en el tratamiento de un proceso
infeccioso específico.
La variedad de métodos y pruebas especiales
destinadas al estudio de la susceptibilidad y respaldo al
tratamiento antimicrobiano son muy variados y se han ido
perfeccionando a través del tiempo con el propósito
de hacerlos cada vez más eficientes y
efectivos.
Antibiograma: Es la prueba en la cual enfrentamos un
microorganismo a una concentración conocida de una droga
antimicrobiana para evaluar su efecto midiendo el crecimiento
microbiano a una temperatura y tiempo dados y comparándolo
con un estándar de referencia. Los métodos se basan
en la dilución o difusión del antibiótico en
medios específicos en los que se cultiva el microorganismo
y en todos los casos los resultados se interpretan a
través de las siguientes categorías de
susceptibilidad:
Susceptible (S) Significa que el microorganismo
causante del proceso infeccioso debe responder exitosamente
al tratamiento aplicado a las dosis habituales y por una
vía apropiada.Medianamente Susceptible o Intermedio: (MS o I)
Significa que el microorganismo solo se inhibirá por
la droga si se aplica una dosis máxima y por una
vía parenteral. (Salvo excepciones, estos medicamentos
no deben ser seleccionados para el tratamiento, sobre todo
aquellos en los que la dosis terapéutica está
muy cercana a los rangos de toxicidad).Resistente: (R) Significa que el microorganismo no
se inhibe por el antibiótico a las concentraciones
sistémicas usualmente alcanzables por la droga cuando
es aplicada por la vía y en las dosis
adecuadas.
Métodos
a) Macrodilución en caldo: Fue el
primero que se desarrolló y constituye el
método de referencia. Se realiza en tubos de ensayo
conteniendo un medio de cultivo líquido (caldo Mueller
Hinton) y en el que se realizan diluciones sucesivas de un
antibiótico partiendo de una concentración
conocida. Posteriormente se inocula cada tubo con igual
cantidad de un inóculo estandarizado del
microorganismo de prueba. Se incuba durante 18-24 horas
tiempo al cual se realiza la lectura a simple vista buscando
turbidez indicadora de crecimiento microbiano. Lectura: se
identifica el tubo con la menor concentración del
antibiótico a la cual no se obtuvo crecimiento
microbiano visible (ausencia de turbidez) o lo que es lo
mismo, la concentración mínima inhibidora (CMI)
que se expresa en &µg/mL (Figura 1) y los
resultados se comparan con los estándares de
referencia específicos que han sido internacionalmente
normados para diferentes microorganismos o grupos
microbianos. El laboratorio informa el valor de la CMI
determinada para cada antibiótico acompañado de
la categoría de susceptibilidad correspondiente.
Ventajas: método más exacto. Desventajas: gran
complejidad de realización y costo elevado.
Fig.4.1: Test de
macrodilución en caldo. En los tubos donde hay menor
concentración del antibiótico (tubos de la
izquierda) aparece turbidez indicadora de crecimiento
bacteriano. Contando de derecha a izquierda, la
concentración de la droga contenida en el tubo ( 6 se
correspondería con la CMI para ese
antibiótico.
b) Microdilución en caldo: El mismo
método llevado a microtécnica. Tiene como
ventajas que emplea menor cantidad de recursos y se facilita
su ejecución Se realiza en placas de
microtítulo de fondo plano con tapa, destinadas para
estos fines. Diferentes métodos automatizados utilizan
como base esta variante y se considera el método ideal
para monitorear el tratamiento antimicrobiano en el paciente
grave. La lectura, informe del laboratorio e
interpretación de los resultados se realiza de igual
forma a la antes descrita.c) Método de Bauer-Kirby: Es el
internacionalmente recomendado para la práctica
hospitalaria de rutina dada su sencillez y bajo costo, no
obstante, está sujeto a múltiples errores
técnicos razón por la que su realización
requiere de un exhaustivo control de la calidad. Se realiza
en placas de cultivo con Agar de Mueller-Hinton sobre las que
se extiende el microorganismo de prueba con un hisopo de
algodón estéril. Posteriormente sobre la
superficie de la placa inoculada se colocan pequeños
discos, comercialmente preparados, impregnados con
concentraciones estandarizadas de los diferentes
antibióticos y debidamente identificados. Las placas
se incuban por un periodo de18-24 horas. Lectura: El
antibiótico impregnado en el disco al hacer contacto
con la superficie húmeda de la placa de agar
difundirá en el medio impidiendo el crecimiento del
microorganismo de prueba en correspondencia con su grado de
susceptibilidad (halo de inhibición). Con una regla
plana se mide en milímetros el halo obtenido en cada
caso y se compara éste con los datos reflejados en las
tablas de referencia para la interpretación de los
resultados. Fig. 3 y 4. El Laboratorio informará el
antibiótico acompañado de la categoría
de susceptibilidad correspondiente.
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