Cultivo de cardiomiocitos humanos en terapia celular para el tratamiento de cardiomiopatía isquémica (página 2)

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Es fundamental desarrollar estudios que nos ayuden a
determinar cuál es la fuente ideal de células, si
es mejor administrar células inmaduras y estimular su
diferenciación in vivo o por el contrario es preferible la
administración de células comprometidas a una
estirpe celular; cómo se deben administrar; cuántas
células son necesarias, etc.

Objetivos

Objetivo
General

Extraer cardiomiocitos de pacientes que hayan
padecido cuadros clínicos relacionados con
Cardiomiopatías Isquémicas, con el objetivo de
producir un cultivo de tejido de células cardiacas que
posteriormente pueda ser implantado in vivo en el paciente
para regenerar el tejido infartado.

Objetivos
Específicos

Caracterizar los medios de cultivo
específicos que se necesitan para que las
células cardiacas crezcan en las mejores condiciones
posibles para su posterior trasplante.
Analizar la viabilidad de los cardiomiocitos
cultivados a través de métodos de conteo
celular y evaluación de tasa de
crecimiento.
Determinar la capacidad regenerativa del
corazón, a partir de la asimilación tisular, de
las células cardiacas cultivadas para el tratamiento
de infartos e isquemias cardiacas.
Utilizar el formato de ·"consentimiento
informado" como herramienta para realizar estudios
anatomopatológicos y biotecnológicos
directamente en humanos, teniendo en cuenta todo tipo de
normas legales y bioéticas.

Ubicación
del problema a investigar

Las enfermedades cardiovasculares constituyen hoy la
primera causa de muerte, siendo las más representativas la
cardiopatía isquémica y el infarto agudo de
miocardio (IMA) (Bedoya et al, 2004).

La posibilidad de inducir el desarrollo de
cardiomiocitos en el corazón adulto se ha considerado una
estrategia prometedora en el tratamiento de enfermedades como la
insuficiencia cardíaca, la hipertrofia o la
cardiopatía isquémica (Tam et al, 1995).
Sin embargo, las características específicas de las
células cardíacas, y la idea que se ha mantenido a
lo largo de muchos años sobre su incapacidad para entrar
en el ciclo celular y dividirse de forma activa, han hecho que
este enfoque haya sido descartado.

En los modelos animales, la posibilidad de realizar
terapia celular utilizando cardiomiocitos ha sido estudiada desde
1993 con la línea AT1 (Koh et al, 1993). Los
cardiomiocitos del corazón adulto se consideraron durante
mucho tiempo incapaces de replicarse. Por esta razón, los
estudios iníciales utilizaron cardiomiocitos de origen
embrionario o fetal (Leor et al, 1996). Varios trabajos
realizados en ratas, muestran el éxito de los injertos de
cardiomiocitos embrionarios en corazones normales o lesionados
(Soonpaa et al, 1994).

Existen distintos estudios experimentales que han
valorado la utilización de fuentes celulares distintas
como forma de regeneración cardíaca (Kessler and
Byrne, 1999) entre las que podemos destacar las células
madre embrionarias (Kehat et al., 2001), células madre de
adulto obtenidas de médula ósea (Orlic et al.,
2001; Toma et al., 2002) , células de músculo
cardíaco obtenidas fetos (Yokomuro et al., 2001) o
células derivadas de músculo esquelético
(Taylor et al., 1998) . Clinicamente tan solo se han desarrollado
aplicaciones en humanos de células derivadas de
músculo esquelético (Menasche et al.,
2001).

Existen pocos estudios relacionados con el cultivo
celular de cardiomiocitos humanos sanos en pacientes que padezcan
enfermedades coronarias severas, de tal forma que se pueda
realizar trasplante celular para regeneración de tejido
cardiaco muerto; quizás debido a la creencia de la poca
actividad mitótica de las células cardiacas, no
obstante las investigaciones en animales, parecen mostrar
resultados prometedores.

Hipótesis

El cultivo celular de cardiomiocitos, es una
metodología viable puesto que estas células se
mantendrán en crecimiento por un tiempo determinado
adecuado para su utilización en terapia de trasplante
de tejido.
El trasplante de cardiomiocitos cultivados in vitro
a tejido cardiaco isquémico responderá
positivamente con la regeneración del tejido afectado,
dando como resultado una recuperación del
paciente.

Marco
teórico

Cardiomiopatía
Isquémica

Las enfermedades del miocardio constituyen el
común denominador de un extensísimo y variado grupo
de procesos patológicos que envuelven el miocardio
causando un amplio espectro de disfunciones cardíacas
(Suárez et al, 2001).

La cardiopatía isquémica es un conjunto de
enfermedades del corazón o cardiopatías cuyo origen
radica en la incapacidad de las arterias coronarias
(coronariopatía) para suministrar el oxígeno
necesario a un determinado territorio del músculo
cardiaco, lo que dificulta el funcionamiento de éste. Por
ello, el corazón enferma debido a la mala función
de las arterias coronarias.

La causa más frecuente de la alteración de
las arterias coronarias es la arteriosclerosis, es decir el
endurecimiento y engrosamiento anormal de la pared de las
arterias, que tienden a obstruirse o la aterosclerosis, un tipo
de arteriosclerosis que se produce por el depósito de
sustancias en el interior del vaso sanguíneo en forma de
placas de ateromas que reducen la luz de la arteria, por lo que
disminuyen el flujo de sangre que la arteria puede transportar al
miocardio. Estas dos situaciones dificultan la llegada de la
sangre a las células del corazón, que son muy
sensibles a la disminución del aporte de sangre.
Así, la cantidad de oxígeno que llega al
corazón es insuficiente y se manifiesta la enfermedad
coronaria o cardiopatía isquémica.

Como ya ha sido señalado anteriormente en
relación a la aterosclerosis, la obstrucción
paulatina de las arterias va disminuyendo el riego y en el caso
de las arterias coronarias la obstrucción puede pasar
inadvertida hasta que se compromete la luz arterial
aproximadamente en 70 %, momento en el cual comienza a
presentarse el desequilibrio entre la oferta y la demanda de
oxígeno por parte del miocardio. Usualmente cuando existe
una obstrucción de tal magnitud, la cantidad de sangre que
pasa durante el reposo es suficiente para suplir las necesidades
metabólicas del área irrigada, pero cuando el
sujeto realiza un ejercicio aparece el desequilibrio entre oferta
y demanda y con ello aparece la isquemia de la zona tributaria
del vaso obstruido. En esta forma se relacionan la
obstrucción ateromatosa coronaria y la angina de pecho
estable.

La posibilidad de utilizar células madre para
regenerar o mejorar la función del corazón
isquémico, principalmente después de un infarto, es
objeto actualmente de numerosos estudios (Menasché, 2002
& Van der Heyden et al, 2003). Se basan en la
utilización de diferentes tipos de progenitores,
injertados directamente en el miocardio lesionado o inyectados en
la circulación. El objetivo general es que las
células trasplantadas, alogénicas o
autólogas, se diferencien en miocitos y participen en la
mejoría funcional de los ventrículos afectados. Lo
ideal es que las células injertadas contribuyan a la
contracción sincrónica, integrándose
anatómicamente a las fibras miocárdicas
preexistentes (Lahagarre et al, 2003).

Existen distintos estudios experimentales que han
valorado la utilización de fuentes celulares distintas
como forma de regeneración cardiaca (Kessler & Byrne,
1999) entre las que podemos destacar las células madre
embrionarias (Kehat et al., 2001), células madre de adulto
obtenidas de médula ósea (Orlic et al., 2001; Toma
et al., 2002) , células de músculo cardíaco
obtenidas fetos (Yokomuro et al., 2001) o células
derivadas de músculo esquelético (Taylor et al.,
1998) . Clínicamente tan solo se han desarrollado
aplicaciones en humanos de células derivadas de
músculo esquelético (Menasche et al.,
2001).

Los Cultivos
Celulares

Potencialmente todas las células son cultivables,
pero cada una de ellas presenta peculiaridades y requerimientos
específicos (Nardote, 1987). Ello hace que
existan numerosos modelos diferenciados de cultivo
celular.

Según su estructura, se pueden diferenciar tres
grandes grupos de cultivo celular: cultivo de órgano,
cultivo de tejido y cultivo de células aisladas. En el
cultivo de órgano y de tejido, se mantienen la estructura
y función intactas del órgano entero o de una parte
del mismo, sin disociar sus células (Kondo, et al
1991). Se dispone así de una población
heterogéneo de células que se puede mantener
sólo durante un período de tiempo limitado
(Douglas et al, 1980).

El cultivo de células aisladas es un sistema
biológico que logra la supervivencia fuera del organismo
de células independientes, pero capaces de dividirse y
mantener sus funciones in vitro. Esta última modalidad se
denomina también cultivo en monocapa o suspensión y
es la más utilizada habitualmente (Michikawa et al,
1991). Existe también la posibilidad de realizar un
cultivo limitado en el tiempo de organelas subcelulares como las
mitocondrias, retículo sarcoplasmático y
ribosomas.

No todas las células presentan las mismas
características dinámicas y de mantenimiento en
cultivo (Ham, 1981). Así, existen células
sin capacidad de reproducción o división celular
que se pueden mantener en medios de cultivo de forma limitada y a
las que se denominan células terminales. Tal es el caso de
las neuronas o de las células
miocárdicas.

Según la fuente de obtención de
células, un cultivo se denomina primario si procede
directamente del organismo vivo, y secundario cuando se obtiene
de la resiembra de otro cultivo. A partir de este punto se puede
hablar de líneas celulares, ya que se trata de
células que mantienen sus características de una
forma constante y homogénea a lo largo del tiempo. Un
cultivo puro es el que contiene células de un solo tipo,
pero existen también cultivos celulares mixtos, en los que
coexisten células de diversos tipos celulares, por ejemplo
músculo estriado y nervio (Michikawa et al,
1991).

Si las células proceden de un tejido compacto,
deben primero someterse a técnicas de disociación
mecánica y/o enzimática que las independicen y
faciliten así su contacto entre sí y con la
superficie de cultivo. Para la disociación
mecánica, se emplean técnicas de microcorte,
separación por vibración, centrifugación
diferencial o electroforesis (Kaighn et al, 1984). Para
la disociación enzimática, se utilizan enzimas
proteolíticas (tripsina, colagenasa, pronasa, dispasa)
encargadas de romper la matriz intersticial sin causar
lesión celular, aunque este último término
no siempre se consigue plenamente.

Las células deben mantenerse en unas condiciones
ambientales y nutritivas correctas para su subsistencia
(Iturralde et al, 1987), para ello se incluyen en un
medio de cultivo apropiado. Aun cuando la mayoría de
medios de cultivo presentan una composición similar, cada
tipo celular tiene unos requerimientos diferenciales
(Taúb et al 1990). Por ello, se han desarrollado
numerosos medios de cultivo específicos para un
determinado tipo celular.

A los medios de cultivo es frecuente añadirles
suero con el objeto de mejorar sus características
citodinámicas (Sato et al 1975); Además
del medio de cultivo, existen diversos aditivos como son los
extractos embrionarios, hormonas (corticoides, insulina) y los
factores de crecimiento que pueden ayudar a modificar las
características de la dinámica de
reproducción y diferenciación de las células
en cultivo.

Todo el sistema de cultivo debe mantenerse a su vez en
condiciones óptimas de temperatura y oxigenación,
preservándolo de una posible contaminación. Para
ello se utilizan las estufas de cultivo que mantienen unas
condiciones ambientales de temperatura, humedad y
oxigenación constantes. Para garantizar la estabilidad en
el pH celular, se adicionan a los medios de cultivo tampones
biológicos (CO3H-, PO4H-, HEPES), junto con un indicador
(rojo fenol) que nos marcará cualquier cambio del
mismo.

Por sus características biológicas, los
cultivos celulares pueden ser contaminados fácilmente por
numerosos gérmenes (Cour, 1979). De ellos, la
contaminación bacteriana es potencialmente controlable
mediante la adición de pequeñas cantidades de
antibióticos (penicilina, gentamicina) al medio de
cultivo, y la contaminación fúngica mediante la
adición de anfotericina B. Sin embargo, muchos autores
propugnan la no utilización de antibióticos en el
medio ya que pueden interferir en los procesos metabólicos
celulares y alterar las condiciones del cultivo (Nardone et
al 1987).

El mantenimiento de un ambiente aséptico no se
limita a los medios y frascos de cultivo sino que debe extenderse
a la habitación donde se realizan los mismos y a todos los
pasos intermedios referidos (Freshney et al 1987). La
habitación o dependencia donde se realizan los cultivos
debe estar aislada del exterior, evitando corrientes de aire y el
acceso de partículas de polvo mediante la
instalación de aireación controlada y filtrada, con
un flujo vertical descendente. La disección del tejido,
disociación y cambios de medio deben realizarse siempre en
una campana de flujo aéreo laminar vertical que evita la
introducción de partículas desde el medio al
cultivo. El operador debe equiparse de guantes estériles,
mascarilla y además utensilios habituales de una estricta
técnica aséptica.

Cultivo Celular
de Células Cardiacas

Varios trabajos estudian la utilización de
cardiomiocitos aislados en el período neonatal. Estos
cardiomiocitos del recién nacido parecen formar uniones
celulares con el miocardio del receptor, pero sufren una muerte
celular importante poco tiempo después de injertarse,
encontrándose después aislados en un tejido
cicatricial (Reinecke et al, 1993). Este fenómeno
está relacionado probablemente con los fenómenos
inflamatorios y necróticos que ocurren después del
infarto. Así, para algunos autores, el trasplante de
cardiomiocitos podría ser más eficaz en las
miocardiopatías dilatadas (Yoo et al, 200). En cualquier
caso, la utilización de cardiomiocitos no adultos plantea
problemas éticos mayores y una vía de
investigación diferente se desarrolla con la
utilización de los cardiomiocitos maduros.

El músculo cardíaco esta compuesto
principalmente por células musculares especiales, estroma
producido por fibroblastos y vasos. Aunque la utilización
de músculo esquelético para regenerar el tejido
cardíaco dañado ha demostrado su eficacia, la
posibilidad de utilizar células con capacidad de
diferenciarse hacia músculo cardíaco tiene
teóricamente mayor interés.

Los cardiomiocitos en mitosis representan
aproximadamente 14 células/millón en el
corazón normal, multiplicándose por 10 en el caso
de un infarto agudo de miocardio. Ha sido calculado que en el
ventrículo izquierdo de un hombre de 45 años hay
aproximadamente 5 x 109 focos de miocitos con un índice
mitótico de 14 focos/106 células, lo que significa
que 81.000 focos están en mitosis en un momento dado. Las
mitosis duran aproximadamente una hora y un número
importante de nuevos miocitos son producidos anual mente (Grounds
et al, 2002). Como existe también una pérdida
progresiva de miocitos, estimada en 6,4 x 106 cardiomiocitos cada
año, un turn-over lento de cardiomiocitos se produce
probablemente a lo largo de toda la vida.

Aunque el estudio de los corazones post-mortem muestra
que la multiplicación de los cardiomiocitos aumenta
significativamente después del infarto (18), desde un
punto de vista clínico esta proliferación parece
incapaz de restaurar el músculo dañado (Rosenthal
et al, 2001). Sin embargo, la identificación de una
población de cardiomiocitos que proliferan en el
corazón adulto, abre la posibilidad de estimularlos in
vivo o aislarlos y multiplicarlos ex vivo para trasplantarlos en
las regiones infartadas (Reinlib et al, 2000 & Li RK et al,
2000). Varios estudios están en fase de realización
para determinar con precisión los mecanismos celulares y
secretores que regulan la multiplicación de los
cardiomiocitos desde el nacimiento.

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