Indice
1.
Introducción
2. Tipos de
microscopios
3. Microscopia
electrónica
Un microscopio
simple (de un lente o varios lentes), es un instrumento que
amplifica una imagen y permite
la observación de mayores detalles de los
posibles a simple vista. El microscopio
más simple es una lente de aumento o un par de
anteojos.
El poder de
resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para
ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a
esa distancia.
El microscopio aumenta la imagen hasta el
nivel de la retina, para captar la información.
La resolución depende de la longitud de onda de la fuente
luminosa, el espesor del espécimen, la calidad de la
fijación y la
intensidad de la coloración.
Teóricamente la máxima resolución que se
puede alcanzar es de 0,2 um dada por una luz con longitud
de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible
por el ojo humano) y con objetos condensadores
adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero
no puede aumentar la resolución.
Existen distintos microscopios ópticos generales y de
investigación que se diferencian en
factores tales como la longitud de onda de la iluminación del espécimen, la
alteración física de la luz que incide en
la muestra y
procesos
analíticos que se aplican a la imagen final.
Microscopio de campo claro – Es descendiente de
los disponibles a partir de 1800.
Compuestos por:
Fuente luminosa que ilumina la muestra
Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra
Platina sobre la cual se coloca la muestra
Objetivo que
recibe la luz que atravesó la muestra
Ocular que recibe directamente la imagen formada por el
objetivo
La muestra a
observar debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz.
Con este tipo de microscopio se deben utilizar métodos de
tinción porque el campo claro de este no produce un nivel
útil de contraste.
Microscopio de contraste de fase – Permite observar
células
sin colorear y resulta especialmente útil para células
vivas.
Este aprovecha las pequeñas diferencias de los
índices de refracción en las distintas partes de
una célula y
en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por
regiones de mayor índice de refracción experimenta
una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz
principal de ondas de luz que
pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase
por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y
del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de
fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil
sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a
las porciones densas del espécimen; las partes claras de
la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto
estos microscopios se utilizan para observar células
vivas, tejidos vivos y
cortes semifinos no coloreados.
Dos modificaciones del microscopio de fase son el
microscopio de interferencia y el microscopio de interferencia
diferencial.
Microscopio de campo oscuro – El objetivo recibe la luz
dispersa o refractada por las estructuras
del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de campo
oscuro está equipado con un condensador especial que
ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el
campo visual se observa como un fondo oscuro sobre el cual
aparecen pequeñas partículas brillantes de la
muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo.
El efecto es similar a las partículas de polvo que se ven
en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una
habitación oscura. La luz reflejada por las
partículas de polvo llegan hasta la retina del ojo y las
hacen visibles.
La resolución de este microscopio no puede ser mejor que
la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente
de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas
individuales más pequeñas en las imágenes
de campo oscuro, debido al contraste creado.
Es útil para observar autorradiografías, cristales
en la orina y para detectar espiroquetas en particular el
Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis.
Microscopio de fluorescencia – Una molécula que
fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro
del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz
ultravioleta. Se usa para revelar moléculas fluorescentes
naturales, como la vitamina A y algunos neurotransmisores. Al ser
escasas las moléculas autofluorecentes su
aplicación más difundida es para revelar una
fluorescencia agregada, como en la detección de
antígenos o anticuerpos en procedimientos de
coloración inmunocitoquímica. También se
puede inyectar moléculas fluorescentes específicas
en un animal o directamente en células y usarlas como
marcadores. Estos métodos
sirvieron para estudiar uniones intercelulares, trayectorias de
las fibras nerviosas en neurobiología y en
detección de marcadores del crecimiento fluorescentes en
tejidos
mineralizados.
Se insertan distintos filtros entre la fuente de luz
ultravioleta y la muestra para producir luz monocromática
o casi monocromática, o entre el espécimen y el
objetivo permitiendo que la estrecha banda de longitudes de onda
de fluorescencia llegue hasta el ojo o incida en una
emulación fotográfica u otro procedimiento
analítico.
Microscopio de barrido confocal – Se usa para
estudiar la estructura de
los materiales
biológicos. Emplea un sistema de
iluminación con rayo láser que
es muy convergente y, en consecuencia produce un punto de barrido
muy poco profundo. La luz que emerge del punto es dirigida a un
tubo fotomultiplicador, donde es analizada. Se utiliza un
sistema de
espejos para mover el rayo láser a
través del espécimen, iluminando un solo punto por
vez. Se registran los datos de cada
punto de la muestra recorrida con este rayo móvil y se
guardan en una computadora.
Luego se puede llevar la imagen a un monitor de
alta resolución. Este método
tiene la ventaja de que se pueden tomar imágenes
de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de foco se
restan de la imagen mediante un programa para dar
una definición máxima a la imagen.
Es posible también crear imágenes
múltiples a diferentes profundidades dentro del
espécimen y realizar reconstrucciones
tridimensionales.
Microscopio de luz ultravioleta – La imagen en el
microscopio de luz ultravioleta depende de la absorción de
esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz
ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto
puede alcanzar una resolución de 0,1 um. La microscopia
ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un
espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en
fotografías. La muestra no se puede observar directamente
a través del ocular porque la luz ultravioleta puede
dañar la retina.
El método
sirve para detectar ácidos
nucleicos, proteínas
que contienen determinados aminoácidos. Mediante
longitudes de ondas
específicas para la iluminación se puede obtener
mediciones espectrofotométricas para cuntificar el DNA y
el RNA de cada célula.
Microscopio de polarización – Este microscopio es
una simple modificación del microscopio óptico,
contiene un filtro polarizante llamado polarizador entre la
fuente de luz y la muestra y se ubica un segundo polarizador,
denominado analizador entre el objetivo y el observador.
Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia
entre sus ángulos de rotación se usa para
determinar el grado en que una estructura
afecta el haz de luz polarizada. La capacidad que tiene un
cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz
polarizada se denomina birrefringencia.
Exhiben birrefringencia el músculo estriado o
esquelético y las inclusiones cristaloides de las
células intersticiales testiculares.
3. Microscopia
electrónica
Dentro de los microscopios electrónico tenemos el
de barrido y el de transmisión.
La ventaja de los microscopios electrónicos frente a los
ópticos esta en que la longitud de onda del haz de luz es
aproximadamente 1/200, lo cual aumenta la resolución.
Microscopio electrónico de transmisión – La
óptica
es muy similar al óptico pero se diferencia en que usa un
haz de electrones en vez de un haz de luz visible.
Este microscopio se basa en los siguientes principios:
– Una fuente, un filamento de tungsteno calentado que emite
electrones (cátodo)
- Un ánodo, hacia el cual son atraídos
los electrones - Una diferencia de potencial entre el cátodo y
el ánodo imparte un voltaje de aceleración entre
20.000 y 200.000 voltios a los electrones, que crea la
haz - El haz pasa por una serie de electroimanes que tienen
las mismas funciones que
las lentes de vidrio de un
microscopio óptico
El condensador forma el haz y modifica el
diámetro del haz que incide en el plano del
espécimen. El haz que atraviesa la muestra se coloca en
foco y se aumenta por medio de un objetivo y se aumenta aun
más con una o más lentes proyectoras. La imagen
final se visualiza sobre una planilla cubierta por
fósforo. Las porciones de la muestra que han sido
atravesadas por los electrones aparecen brillantes, las porciones
que absorvieron o esparcieron los electrones por su densidad
inherente o debido al agregado de metales pesados
durante la preparación del espécimen aparecen
oscuras. Se coloca una placa fotográfica o un detector de
video por
encima o por debajo de la pantalla del visor, con la finalidad de
obtener un registro
permanente de la imagen sobre la pantalla.
Las muestras se preparan sobre la misma base que la del
microscopio óptico pero requieren métodos
más finos.
Los preparados la restricción que tienen es que en cada
paso se trabaja con especimenes de magnitud 3-4 órdenes
menores o más finos que los utilizados para el microscopio
óptico. Debido a la gran resolución de estos
microscopios electrónicos la calidad de la
fijación, es decir el grado de preservación de la
estructura subcelular debe ser la mejor posible.
La preparación de rutina de los especimenes para la
microscopia electrónica de transmisión comienza
con la fijación con glutaraldehído, seguida de un
lavado con un buffer y de una fijación con
tetróxido de osmio.
Por lo general, se fijan para el microscopio electrónico
de transmisión piezas de tejido no mayores de 1
mm3
El proceso de
deshidratación es idéntico al empleado en la
microscopia óptica
El tejido incluido en material plástico
se secciona por medio de micrótomos especialmente
diseñados, que usan cuchillas de diamante.
Debido al limitado poder de
penetración de los electrones, el espesor de los cortes
preparados para el microscopio electrónico de
transmisión varia entre 50 nm y 150 nm. Estos cortes son
demasiado finos para poder ser manipulados; se los hace flotar
desde el filo de la cuchilla en la superficie de una bandeja
llena de líquido, se recuperan y se colocan en rejillas de
malla de cobre
recubiertas por plástico.
Estas rejillas tienen 50-400 orificios por pulgada o hendiduras
especiales para observar cortes seriados.
Por lo general, la coloración de los cortes para
microscopio electrónico de transmisión se realiza
por medio del agregado a la muestra de materiales de
elevada densidad, tales
como iones de metales pesados.
Estos iones de metales pesados se unen a los tejidos durante la
fijación o la deshidratación o al sumergir las
muestras en soluciones de
tales iones después del corte. El teróxido de osmio
que se emplea de rutina en el fijador se une a los componentes
fosfolipídicos de las membranas, lo cual agraga densidad a
la membrana.
A menudo se agrega nitrato de uranilo a las soluciones
alcohólicas usadas en la deshidratación, con el fin
de agregar densidad a los componentes de las uniones celulares y
a otros sitios. La inmersión secuencial en soluciones de
acetato de uranilo y citrato de plomo se usa rutinariamente para
teñir los cortes antes de observarlos con microscopio
electrónico de transmisión.
La congelación-fractura es un método especial de
preparación de la muestra para microscopia
electrónica de transmisión, de gran importancia en
el estudio de membranas.
El material a examinar puede estar fijado o no; en el primer caso
se elimina el fijador del tejido por medio de lavados, antes de
procesarlo. Se infiltra el tejido con un crioprotector, como el
glicerol y se congela rápidamente a unos –160 grados
centígrados.
Microscopio electrónico de barrido – Se
asemeja más que al microscopio electrónico de
transmisión a los tubos de televisión
de donde deriva la microscopia electrónica. Para analizar
la mayoría de los tejidos se deja la muestra, se
deshidrata por desecación de punto crítico, se
cubre con una película evaporada de oro-carbón, se
monta en un taco de aluminio y se
coloca en la cámara de muestras del microscopio. En los
tejidos mineralizados es posible eliminar todos los tejidos
blandos con una lejía y analizar las características estructurales del
mineral.
Se logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el
haz de electrones a través de la superficie un tubo de
televisión. Los electrones reflejados desde
la superficie y los electrones forzados hacia el exterior de la
superficie son captados por uno o más detectores y
reprocesados para formar una imagen tridimensional en un
televisión.
Se pueden tomar fotografías para registrar los datos o la imagen
en una cinta de video. Se pueden
usar otros detectores para medir los rayos X emitidos
desde la superficie, la catodoluminiscencia de las
moléculas del tejido por debajo de la superficie y los
electrones de Auger emitidos en la superficie.
Muchos microscopios combinan las características de un microscopio
electrónico de transmisión y de barrido, el cual
permite microanálisis por rayos X con sonda
electrónica.
Se pueden adosar detectores al microscopio para reunir los rayos
X emitidos cuando el haz de bombardea el corte
histológico, y mediante analizadores apropiados se
construye un mapa que muestra la distribución en los cortes de los elementos
que tienen número atómico mayor de 12, en
concentración suficiente para producir rayos X en cantidad
tal que se pueda analizar.
Autor:
gon2002