Insecticidas biológicos en el control de insectos plaga: agrícolas, forestales, de almacén y urbanas en México (página 2)

Centros Regionales de Reproducción de Organismos Benéficos
(CREROB)

Taxonomía
de Bacillus thuringiensis (B.th)

Según el manual de Bergey
(2001) B.th es una bacteria Gram positiva aerobia
estricta, heterotrófica, que forma una espora por célula
vegetativa y simultáneamente un cuerpo llamado paraesporal
o cristal de proteína, de morfología
variada: cubos, rombos, amorfos, como se muestran en la figura 2,
también conocida como d-endotoxina que intoxica a
los diferentes ordenes de IP, de acuerdo
con su estructura
molecular (10-12).

III.1 Distribucción de B.th en el
ambiente.

Las esporas B.th se recuperan de: suelo
agrícola, virgen, de hojas de plantas, de
insectos, de granos y de fabricas de alimentos para
animales a
base de productos
vegetales, pueden ser reservorios de las esporas de
B.th, su identificación se inicia con la
detección del cristal al microscopio de
luz, como se
muestra en la
figura 1, cuando crece en caldo nutritivo, además de su
perfil bioquímico y el antígeno flagelar, aspecto clave para la
taxonomía de las variedades reconocidas
hasta la actualidad, también existe la dependiente del
origen genético sus característicos cristales
(13-15).

Figura 1. Microfotografía al
microscopio de luz 100 X de Bacillus thuringiensis var
kurstaki con su cuerpo paraesporal en caldo nutritivo a 40 h
de incubación.

.

Figura 2. Microfotografia al microscopio
electrónico de cristales de
d-endotoxina de Bacillus thuringiensis var
kurstakii en caldo nutritivo.

Tipos de toxinas
producidas por B.th.

En las diferentes estadios de su ciclo biológico
Bth sintetiza 3 tipos de toxinas: en el vegetativo Iy II
genera 2: una a-exotoxina o fosfolipasa C y la
ÃY-exotoxina, durante III al VI de la esporogénesis
produce la d-endotoxina codificada por genes plasmídicos
(1,9,11).

La a-exotoxina, ha sido poco investigada perose reporta
con actividad toxica contra Galleria mellonella, aunque
también lo es para mamíferos. Químicamente la
ÃY-exotoxina o thuringiensin, es toxica, porque causa la
inhibición de la RNA polimerasa por competición con
el ATP, la ÃY-exotoxina se supone, que es una señal
molecular en B.th en el control de la
transcripción de genes relacionados con la
esporulación, es un derivado de nucleótido de
adenina unido a glucosa y con
un ácido fosfoalárido, tóxico para la mosca
domestica, aunque teratogénica para animales de laboratorio
(12,14,17).

La d-endotoxina es la más estudiada de las
producidas por B.th tiene naturaleza
proteica, con un peso molecular de 1.34X105 Daltons, constituida
por 18 de los 20 aminoácidos, en su estructura
tridimensional tiene un 20% de a-hélice, 35% de lamina
ÃY-plegada y el 45% es desconocido (16-18).

IV.1 Mecanismo de acción
del cristal de B.th en IP.

Cuando un cristal o protoxina es ingerido se activa en
su intestino el pH alcalino
entre 7.5 a 8.0 y por las proteasas digestivas
específicas, que lo convierten en una toxina activa, con
una masa molecular de 68Kda. La proteína tóxica se
inserta en la membrana de las células
epiteliales del intestino medio del IP y causa un canal
iónico con pérdida de ATP, 15 min después el
metabolismo
celular se detiene e inicia la deshidratación que ocaciona
su muerte
(19-21).

Medios de cultivo
para el crecimiento y producción de
B.th.

En la producción del complejo espora/cristal es
necesario cultivar B.th en medio de crecimiento a base
de subproductos del maíz
hidrolizado como el almidón y dextrinas, al igual que jugo
de agave y melaza de caña que contiene fructosa, se
obtienen excelentes resultados para la esporulación y de
calidad
tóxica del cristal (6,17,22).

La melaza de caña contiene diferentes azucares de
bajo peso molecular, que B.th utiliza como fuente de C
de bajo
costo, que tienen un efecto positivo sobre la toxicidad de la
d-endotoxina, mientras que la harina de pescado
(combinación de azucares, proteínas,
vitaminas y
minerales),
como lo es la semilla de algodón, de soya, de garbanzo, de haba, de
cacahuate y de lenteja, también es posible con el
líquido de remojo de maíz; los
residuos de levadura, la sangre
de res, de suero de leche, son
materiales
nutricionales que estimulan la
síntesis de la d-endotoxina con alta
actividad insecticida (3,6,13). Mientras que se usan factores de
crecimiento para mejorar la calidad tóxica del cristal de
B.th como: el extracto de levadura: una fuente de
vitaminas
del complejo B, ya que su carencia retrasa la esporulación
y la formación de cristales en consecuencia la toxicidad
del complejo espora/cristal se reduce considerablemente (7,14,
20).

Cuadro 3. Sustratos naturales usados como medios de
cultivo para la producción de complejo espora/cristal de
Bacillus thuringiensis.

Referencias3,7,10.

Condiciones de
crecimiento de B. th para la formación del complejo
espora/cristal

En la producción del complejo espora-cristal de
B.th se emplea una fermentación sumergida o superficial. El
medio de cultivo se siembra con un 10% de B.th como
inóculo: condiciones de ambos proceso:

temperatura entre 28 y 32 ºC, un pH inicial de 6,8-7,2;
es importante el suministro de oxígeno
por la elevada demanda de
B.th en la fase de crecimiento exponencial, pues su
carencia o limitación disminuye el número de
células vegetativas, en consecuencia habrá pocas
espora y menos d-endotoxina (22,23). Mientras que cuando
se eleva el suministro de oxígeno en medios de cultivo
ricos para B.th, se genera un exceso de espuma que
disminuye las células vegetativas potenciales productoras
de cristales tóxicos para IP, por lo que es necesario
agregar un antiespumante (8,19).

a) En la fermentación sumergida: el
inóculo se usa en un medio de cultivo enriquecido para
suplir la demanda nutricional de B.th (5,10,13) como el
siguiente (en %):

melaza de remolacha (1); residuos de maíz (0.85);
carbonato cálcico (0.1); harina de maiz (1.0); con
base a lo anterior la esporulación y cristal de la
bacteria, alcanzan un valor
aproximado de de 5 x 109 esporas /ml, después de 32 h de
incubación.

Otro medio de cultivo para obtener 5 veces más la
cantidad de esporas y cristales de B.th
(4,17,18,20)contiene lo siguiente (en %):

almidón de maíz (6.8); caseína
(1.94); sacarosa (0.64); extracto de levadura (0.6).

b) En la fermentación superficial

Se emplea un medio de cultivo que contiene lo siguiente
(en %): dextrosa (1.5); maiz (0.45) fosfato de potasio (0.35);
cloruro de calcio (0.01)

VI.1 Recuperación del complejo espora/cristal
de B.th.

El resultado de la fermentación o
formación de los principios
activos
tóxicos para a IP, se obtienen por técnicas
que aplican: la centrifugación, la filtración, la
precipitación o bien una combinación de los
anteriores (12,20,23).

VI.2 Bioensayos para medir la calidad tóxica
del complejo espora/cristal de B.th.

Se prepara un gradiente de concentración con el
complejo espora/cristal, lo que se mezcla con una la dieta
artificial para IP con larvas de diferentes estadios o etapas de
crecimiento del gusano cogollero (Spodoptera frugiperda
L) un problema fitosanitario que reduce considerablemente la
producción de maíz, las larvas se depositan en
recipientes con la dieta, se incuba durante por lo menos 2
semanas 4, posteriormente se determina la concentración
letal media en µg. de proteína/volumen de la
dieta artificial, donde sabremos la cantidad de toxico en la
espora que sea letal para el insecto (1,3,13,15).

Conclusión

El control de IP agrícolas, forestales, de
almacén
y urbanas es una opción ecológica para eliminar o
reducir el impacto negativo de esta clase de
insectos, con la ventaja de que no causa la contaminación ambiental. Sin embargo la
aplicación de agentes biológicos, requiere de un
conocimiento
suficiente de su forma de acción para obtener buenos
resultados, en la regulación de poblaciones de insectos
que son un problema, para la salud de humanos y plantas,
en especial cuando se pretende minimizar el empleo de PQ y
mejorar la calidad de
vida humana.

Se dedica este trabajo a los
promotores del control biológico en el
mundo.

Agradecimientos por el apoyo a: Proyecto 2.7
(2009) CIC-UMSNH, y BIONATURA, SA DE CV,
MÉXICO.

Literatura
citada

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Autor:

Morales R. V.*

Garay R. B.*

Romero H, A.*

Juan Manuel
Sánchez-Yáñez**

*Ingeniería Bioquímica, Escuela Nacional
de Ciencias
Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, Carpio
y Plan de Ayala,
México, D.F. **Microbiología Ambiental. Instituto de
Investigaciones Químico Biológicas,
Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia,
Mich, México.