Experimentos recientes han demostrado que
existe una interacción física entre el core
y el dominio SH2 de la
proteína STAT1 perteneciente a la vía de
señalización del IFN tipo I, por lo que se
dificulta la transducción de la señal generada por
esta citoquina así como un componete esencial en la
respuesta antiviral (Lin y cols., 2006).
Las glicoproteínas de la envoltura del virus son
comúnmente halladas en asociación transiente con
dos tipos de chaperonas (y asociadas a
oxidorreductasas):GRP94 y GRP78
(calnexina/calreticulina) con ERp57 y BiP junto a PDI
(Oliver y cols., 1999; Molinari y Helenius, 2000).
Además, se ha observado que la proteína E2
está más estrechamente unida a la GRP78. Dada la
sobreexpresión de esta chaperona, la cual es un censor del
estrés en
el RE, se ha observado un decremento de la sensibilidad de las
células
a la apoptosis inducida por linfocitos T citotóxicos
CD8+ (LTC); esta actividad de E2 puede estar
involucrada en la patogénesis de enfermedades inducidas por
el VHC (Dubuisson y Rice, 1996). Adicionlamente, fue mostrado que
E2 interactúa con la proteína quinasa inducida por
interferón (PKR) y activada por ARN de doble cadena. El
dominio de fosforilación homólogo (12
aminoácidos) de
PKR-eIF2α(factor de
iniciación de la traducción) en E2 parece estar involucrado
en esta interacción (Taylor y
cols., 1999). Este dominio fue esencial para el bloqueo de la
habilidad inhibitoria de la replicación viral de PKR,
sugiriendo que la interacción de E2 con PKR puede estar
relacionada con la resistencia viral
al IFN.
La presión
inmunitaria sobre las glicoproteínas E1 y E2,
especialmente la región hiper varianble 1 (RHV 1) causa
mutaciones y cambios radicales antigénicos que permiten
evitar la inmunovigilancia (Hoofnagle, 2002). Tanto es
así, que se plantea que la tasa de mutación de la
RHV 1 disminuye cuando el hospedero es inmunodeficiente o
está inmunosuprimido (Kato, 2001). La variabilidad de las
secuencias de E2/ NS1 ha sido asociada con el recrudecimiento de
la hepatitis y la
resistencia a la terapia con IFN (Enomoto y cols., 1994).
El tratamiento con IFN pudiera acentuar las presiones selectivas
inmunitarias normales contra E2/ NS1 (Booth y cols.,
1998). A esto se suma que las mutaciones en los epítopos
de células T están involucradas en el escape a la
inmunidad celular (Weiner y cols., 1995). Así
cuando el inóculo es suficientemente diverso y tras la
primera ronda de replicación en el hígado, el
espectro antigénico de la progenie viral puede ser tan
amplio como para desbordar la capacidad de la respuesta
inmunitaria neutralizante, lo que resulta en el escape de una
parte de la progenie, que llegará de nuevo al
hígado. Si las sucesivas rondas de replicación que
tienen lugar a continuación generan una diversidad
antigénica suficiente en las sucesivas progenies virales,
el fenómeno de escape se repite, y la diversidad se
amplifica hasta alcanzar un grado que sobrepasa de forma
definitiva la capacidad de respuesta del sistema
inmunitario.
Investigaciones recientes han demostrado que el CD81,
considerado el principal receptor de entrada del virus, y su
interacción con la glicoproteína E2 alteran las
funciones
celulares de las células T y las citocidas naturales (NK,
del inglés
natural killer) (Crotta y cols., 2002; Nattermann
y cols., 2004). Adicionalmente, se ha demostrado que las
tetraspaninas también intervienen en la regulación
de la migración
de las células dendríticas, lo que
contribuyó a que posteriormente se demostrara que el CD81
en interacción con E2 altera la migración de las
células dendríticas intrahepáticas hacia
tejidos
linfoides para la presentación del antígeno a células T (Nattermann
y cols., 2006).
Una región de NS5A está asociada con la
sensibilidad al IFN, y se ha demostrado que esta región
designada como región determinante de sensibilidad al IFN
(ISDR, del inglés Interferon Sensivity-Determinig
Region), es útil para la predicción de la
respuesta al IFN debido a la aparición de mutaciones
dentro de esta región discreta (Enomoto y cols.,
1996). Se ha observado que NS5A reprime la PKR a través de
una interacción directa con el dominio catalítico
de la proteína y altera su dimerización in
vivo, lo cual provoca la inhibición de la
fosforilación de
eIF-2αmediada por PKR y por
tanto, la inhibición de la secreción de IFN-α
por la célula
(Zech y cols., 2003). También se ha visto que NS5A
se asocia con p53 y suprime la transcripción del gen p21
regulador del ciclo celular de alguna forma dependiente de p53
(Kato, 2001).
1.3 Respuesta
inmunológica
Los anticuerpos (Acs) generalmente son esenciales en la
defensa del hospedero contra patógenos dentro del espacio
extracelular; dichas proteínas
participan en mecanismos efectores dentro del aclaramiento viral
que incluyen neutralización, activación del
complemento, la opsonización y la toxicidad mediada por
células dependiente de anticuerpos. Existen evidencias
limitadas acerca del papel de la respuesta de anticuerpos
anti-VHC.
La respuesta de anticuerpos (Acs) ha sido un elemento
importante de la inmunidad adaptativa para la protección
frente a muchas infecciones virales. Aunque existen trabajos que
dan fe de la importancia de esta respuesta (Ishii
y cols., 1998; Zein y
cols., 1999), las evidencias acerca del
papel de la respuesta de anticuerpos anti-VHC es
limitada.
La respuesta humoral contra este patógeno se
desarrolla lentamente, y generalmente en la infección
primaria es débil, con excepción de la respuesta
contra core (Chen y cols., 1999). Es característico
de este tipo de respuesta, la restricción de los
anticuerpos a la subclase IgG1, fuera del usual cambio a las
subclases IgG3 o IgG4 que ocurre típicamente con la
maduración de la respuesta humoral antiviral (Chen y
cols., 1999). Se ha demostrado que anticuerpos anti-core del
isotipo IgG se restringen a la subclase IgG 1 (Netski y
cols., 2005), y están presentes en el 95% de los
pacientes con infección crónica; el 12% de los
mismos presentan respuesta de subclase IgG2, el 70% respuesta de
subclase IgG3 y el 19% presentan repuesta IgG4 (Taura y
cols., 1995). Sorprendentemente, se ha asociado al desarrollo de
anticuerpos de subclase IgG2 con el aclaramiento viral. En un
estudio con un pequeño número de individuos, la
respuesta IgG2 contra los antígenos core y NS3, fue muy
frecuente en aquellos que aclararon la infección viral con
respecto a aquellos que desarrollaron infección
crónica (Zein y cols., 1999). De forma similar, la
razón entre los Acs de subclase IgG2 e IgG1 contra core y
NS5 fue mayor que 1.0 en aquellos que aclararon la
infección, sin embargo fue menor que este valor para
aquellos individuos que presentaban infección
crónica. El predominio de esta subclase (IgG2) se ha
asociado con un patrón de respuesta Th1 en respuesta de
células T CD4+ (Tsai y cols.,
1997).
Se ha demostrado que se generan Acs contra,
virtualmente, todos los Ags virales durante el curso de la
infección (Farci y cols., 1991) y se ha encontrado
que aquellos dirigidos contra las proteínas de la
superficie del VHC (E1 y E2) se producen más
frecuentemente en las infecciones persistentes que en las
autolimitadas (Prince y cols., 1999). Las regiones
inmunodominantes son las proteínas de la cápsida,
NS3 y NS4 (Neville y cols., 1997).
La respuesta de anticuerpos neutralizantes generalmente
constituye la primera línea de la defensa adaptativa
contra la infección viral. En individuos con hepatitis
crónica la aparición de altos títulos de Acs
neutralizantes coincide con la desaparición del virus y la
resolución clínica de la hepatitis (Ishii y
cols., 1998).
Los Acs contra las proteínas de la envoltura son
los candidatos fundamentales para la neutralización viral;
se ha demostrado que en chimpancés, la RHV I, es un
dominio de neutralización crítico del VHC y se
sugiere que los Acs anti-RHV I funcionan como Acs neutralizantes.
Mas su presencia en los pacientes crónicos y el hecho de
que los chimpancés pueden ser infectados repetidamente por
cepas idénticas, hace pensar que no siempre la actividad
de neutralización es efectiva in vivo (Esumi y
cols., 1999).
Se han llevado a cabo estudios vacunales con Ags
recombinantes E1-E2 para inducir Acs neutralizantes. Aunque luego
de la vacunación se observó la protección en
los chimpancés, contra retos en bajas dosis, esto fue solo
en períodos de altos títulos de Acs anti-E1-E2
(Choo y cols., 1994). Por lo tanto, se ha sugerido que la
eliminación del virus después de la
infección no está mediada por Acs neutralizantes
(Prince y cols., 1999) y que de hecho, las fuertes
respuestas de células T se correlacionan mejor con la
eliminación del virus y la recuperación, tanto en
humanos como en chimpancés (Cooper y cols., 1999;
Takaki y cols., 2000). Logvinoff y colaboradores,
demostraron que la mayoría de los individuos con
infección persistente poseen respuestas de anticuerpos
capaces de neutralizar pseudotipos de partículas
retrovirales (VHCpp), las cuales expresan glicoproteínas
heterólogas de la envoltura del VHC.
Sin embargo, sólo la minoría de los
individuos con infecciones agudas que fueron estudiados
demostraron alguna actividad neutralizante (Logvinoff y
cols., 2004). Posterior a esta evidencia, se reportó
un estudio con un paciente infectado en 1977 y del cual se tienen
muestras de suero desde esa fecha. Los resultados mostraron que
la repuesta de anticuerpos neutralizantes fallaba a la eficiente
neutralización de las VHCpp que expresaban la
glicoproteínas de las secuencias dominantes in
vivo, en el tiempo
correspondiente a la extracción del suero. Adicionalmente,
todas la VHCpp derivadas de este
paciente eran neutralizadas por anticuerpos séricos
provenientes de dos individuos crónicos (von
Hahn y cols., 2007). Los Acs neutralizantes
contra el VHC puede ejercen una presión selectiva que
conlleva a la aparición de nuevas variantes del VHC que
escapan a la respuesta inmune (Farci y cols, 1994). Aunque
continuamente pudieran producirse Acs neutralizantes contra estas
variantes, el virus seguirá mutando. Por lo que los Acs
neutralizantes y la infección por VHC pueden co-existir en
pacientes crónicamente infectados (Borgia,
2004).
A pesar de las evidencias circunstanciales sobre el
papel de los anticuerpos neutralizantes, los individuos con
hipoganmaglobulinemia son capaces de eliminar la infección
viral a una velocidad
similar a los individuos que autorresuelven la enfermedad y que
no presentan dicha patología (Bjoro y cols., 1994).
Adicionalmente, en estudios realizados utilizando pseudotipos de
partículas retrovirales que expresan las
glicoproteínas del VHC, y sistemas de
ensayos
basados en partículas semejantes a virus (VLPs, del
inglés Virus-Like Particles) ensambladas con las
proteínas estructurales del virus, no fue encontrado
aclaramiento viral (Logvinoff y cols., 2004; Steinmann
y cols., 2004). No obstante, se ha documentado la
existencia de Acs neutralizantes de subtipo IgM
específicos contra el VHC, en el tiempo de la
seroconversión en pacientes que fallan al control de la
infección. Conjuntamente fueron encontrados Acs capaces de
neutralizar pseudotipos autólogos (específicos del
hospedero) y heterólogos (otros genotipos y subtipos no
presentes en el hospedero), en aquellos individuos que
resolvieron la infección aguda (Logvinoff y cols.,
2004). Recientemente, anticuerpos neutralizantes mostraron la
capacidad de prevenir la replicación en sistemas de
cultivo in vitro (Yi y cols., 2006), y la modulación
de la infección por el VHC in vivo (Eren y
cols., 2006).
Los estudios en chimpancés sugieren que la
infección por el VHC no genera una respuesta inmune
esterilizante; sin embargo, genera una respuesta que controla la
infección en términos de su duración, de
replicación viral (niveles de ARN en suero) y el grado de
hepatitis (elevación en los niveles de alanina
aminotransferasa, ALAT), esta respuesta parece ser mediada por
células, ya que no se detectaron Acs contra los
antígenos (Ags) de superficie en los animales
estudiados (Major y cols., 2000).
Los bajos niveles de ARN, el pobre reconocimiento de los
antígenos por los linfocitos T auxiliadores (Th, del
inglés T helper), una pobre secreción de citoquinas
e inadecuada expansión, crecimiento y respuesta de las
células pueden explicar la demora en el desarrollo de la
respuesta inmune.
Se considera que la respuesta inmune celular contribuye
a controlar el virus en primera instancia y potencialmente
conduce a la inflamación hepática durante la
enfermedad crónica. En los pacientes que resuelven la
infección se genera una respuesta temprana, fuerte y
multiespecífica de linfocitos T auxiliadores, así
como de linfocitos T citotóxicos (LTC), que se mantiene
después de la resolución de la viremia y la
normalización de los niveles de ALAT
(Lechner y cols., 2000). No se conoce si esto representa
una verdadera respuesta de memoria o si la
persistencia viral en sitios desconocidos, lleva a la
estimulación continua de la respuesta inmune (Diepolder
y cols., 1996).
Se considera que los linfocitos T CD4+
son críticos para la efectividad de las respuestas tanto
humoral como celular, contra el VHC (Elliot y cols.,
2006). Varios experimentos
llevan a considerar que una respuesta fuerte y
multiespecífica de células T CD4+,
producida en una etapa temprana de la infección
está asociada con la resolución de la enfermedad,
mientras que una respuesta limitada en una etapa más
avanzada se relaciona con la cronicidad de esta enfermedad
infecciosa (Day y cols., 2002; Thimme y cols.,
2002).
En individuos que autorresolvieron la enfermedad se
detectó una respuesta linfoproliferativa contra un
promedio de 10 a 37 epítopos definidos pertenecientes a
las proteínas core, NS3, NS4 y NS5, en comparación
con la respuesta contra solo un epítopo en pacientes que
presentaban infección crónica (Day y cols.,
2002). Los LTC específicos para el core pueden reconocer y
lisar las células que expresan dicha proteína
proveniente de la mayoría, sino de todos los genotipos del
VHC (Nelson y cols., 1997). Más aún,
no se detectan mutaciones dentro de la proteína de la
cápsida, a pesar de la presencia de LTC específicos
(Christie y cols., 1999), lo que sugiere que las
respuestas inmunes contra esta proteína no llevan a la
aparición de variantes que escapan al sistema inmune
(Polakos y cols., 2001). Además, la presencia de
LTC específicos para la proteína de la
cápsida ha estado
asociada con la subsiguiente respuesta de los pacientes a la
terapia con IFN (Nelson y cols., 1998). De esta forma, una
vacuna capaz de generar LTC específicos para la
proteína de la cápsida, pudiera aumentar la tasa de
respuesta de los pacientes frente a la terapia (Polakos y
cols., 2001). En los pacientes que eliminan la
infección viral, las proteínas no estructurales
(NS3, NS4 y NS5) constituyen los principales blancos de la
respuesta T auxiliadora (Rosen y cols., 2002; Schulze y
cols., 2005).
Las causas de la aparente falla de la repuesta de
células T CD4+ en pacientes que desarrollan
infección crónica no se comprende muy bien
aún. Algunas teorías
incluyen el agotamiento y/o la anergia de estas células.
El agotamiento puede resultar de la alta velocidad de producción de los viriones, la cual puede
exceder la capacidad de la respuesta inmune, lo que resulta en
una sobre-estimulación de los linfocitos T, y por tanto,
una afectación de la activación. La anergia puede
resultar por la alta y sostenida concentración
antigénica que conlleva a la tolerancia de la
respuesta inmune (Brooks y cols., 2005).
Evidencias recientes afirman el papel de los linfocitos
T CD4+CD25+Foxp3+
reguladores (TREG) en la supresión funcional de
la respuesta de linfocitos T CD4+ en la
infección por el VHC (Sugimoto y cols., 2005). La
frecuencia y la actividad funcional de los TREG en
pacientes con infección crónica, que tienen
células T CD4+ inactivadas, fueron
significativamente mayores que en pacientes que aclararon la
infección por el VHC, evidenciando que la supresión
es VHC-específica. Además, se ha demostrado la
prevalencia de la secreción de interleukina (IL) 10 y
factor transformador del crecimiento-β (TGF- β, del
inglés Transformig Growth Factor) inducida por el
virus, en la cronicidad, las cuales son características de
los TREG (Ulsenheimer y cols., 2003). Estudios
en chimpancés con infección aguda demostraron que
la frecuencia y la actividad supresora de las células
CD4+CD25+Foxp3+
comenzaba a observarse en la medida que evolucionaban a la
cronicidad (Manigold y cols., 2006).
En conjunto con la respuesta de células T
CD4+, una respuesta potente y
multiespecífica de células T CD8+
generada en una etapa temprana de la infección se ha
relacionado con el aclaramiento viral (Cooper y cols.,
1999; Gruner y cols., 2000; Lauer y cols., 2004).
Sin embargo, la presencia en el hígado de LTC es
suficiente para generar el daño,
pero no siempre para eliminar la infección. No es casual
que en pacientes con hepatitis crónica predomine un perfil
de respuesta Th1 (Sobue y cols.,
2001).
Una respuesta de LTC dirigida contra múltiples
epítopos de las proteínas virales fue observada en
chimpancés que autorresolvieron la infección,
mientras que animales que desarrollaron la cronicidad generaron
una respuesta limitada (Cooper y cols., 1999). Cucchiarini
y colaboradores en el 2000, demostraron una alta prevalencia de
la respuesta de LTC dirigida contra diversos epítopos,
tanto de las proteínas estructurales como no
estructurales, en pacientes que aclararon la infección con
respecto a los que no la aclararon; mientras que Shata y
colaboradores en el 2002, observaron una respuesta temprana y
amplia contra epítopos de core y NS3 en chimpancés
que autorresolvieron la enfermedad, no comportándose de
igual forma en los crónicos. Adicionalmente, se ha
reportado que las células T CD8+ de
pacientes que progresaron a la infección crónica
perdieron el reconocimiento de al menos un epítopo blanco
en la infección primaria, observándose hasta una
reducción de un 85% en la magnitud de la respuesta,
además ninguna especificidad a nuevos epítopos fue
observada en estos pacientes con infección persistente
(Cox y cols., 2005).
Existen datos
conflictivos indicando la constancia de una respuesta de
linfocitos T CD8+ VHC-específica seguida
del aclaramiento viral. Se realizó un estudio donde se
mostró que la respuesta de LTCs persiste en individuos
crónicos y no en pacientes que solucionaron la enfermedad,
lo que sugiere que el mantenimiento
de la viremia es crítico para la persistencia de esta
respuesta celular (Chang y cols., 2001). Adicionalmente,
las células de memoria tanto CD4+ como
CD8+ son encontradas en ausencia del
antígeno en modelos
experimentales (Mullbacher, 1994; Veiga-Fernandes y cols.,
2000), lo que probablemente no ocurre en el contexto del sistema
inmune humano (Zinkernagel, 2002). Variantes del VHC con
alteraciones del tropismo celular quizás son retenidas en
el hígado, pero en células diferentes a los
hepatocitos, así como en células dendríticas
en el drenaje de los nódulos linfáticos, en
células mononucleares de sangre
periférica, o en determinados "sitios santuarios" como el
cerebro (Crovatto
y cols., 2000; Laporte y cols., 2003; Forton y
cols., 2004). Reportes recientes sobre pacientes que
resolvieron la infección, pero que retuvieron bajos
niveles de virus en células mononucleares de sangre
periférica, sugieren que después del aclaramiento,
algunos individuos pueden mantener bajos niveles de viremia,
permitiendo la constante exposición
antigénica, pero sin manifestaciones de hepatitis
crónica (Pham y cols., 2004; Radkowski y
cols., 2005; Gerotto y cols., 2006).
Utilizando tetrámeros del antígeno
leucocitario humano (HLA, de inglés human leucocitary
antige) clase I, se
pudo demostrar que los linfocitos T CD8+ son
detectables con mayor frecuencia en el hígado que en
sangre periférica (Grabowska y cols., 2001), y en
individuos autoresueltos, más que en individuos
crónicos (Lauer y cols., 2004). Similarmente se ha
demostrado una disminución de la producción de
IFN-γ y TNF-α por los LTCs VHC-específicos en
pacientes con infección aguda, los cuales avanzan a la
infección crónica (Spangenberg y cols.,
2005). Datos recientes indican que la vía PD-1/PD-1
ligando juega una papel clave en el agotamiento de estas
células (Barber y cols., 2006).
Las razones de la persistencia viral debido a una
limitada respuesta de LTCs aún siguen sin esclarecerse.
Sin embargo, se considera que el desarrollo de mutantes que
escapan al sistema inmunológico resultado de la alta
velocidad de replicación y de errores de la ARN polimerasa
ARN dependiente, juega el mayor papel en este fenómeno
viral. Se han descrito mutaciones que permiten escapar de los
LTC, en proteínas del VHC tales como NS3 (Weiner y
cols., 1995) y E2 (Tsai y cols., 1998). Erickson y
colaboradores en el 2001, obtuvieron evidencias de una
mutación en múltiples epítopos restringidos
por HLA clase I dentro de los primeros meses de la
infección crónica en chimpancés, no siendo
así en epítopos no restringidos por esta
molécula. El análisis intensivo de la respuesta de
linfocitos T CD8+ en un caso-control de individuos
HLA-B27+ con infección, tanto aclarada como
crónica, permitió la identificación de
epítopos restringidos por HLA-B27, que fueron reconocidos
por la mayoría de los casos aclarados, indicando un
presión selectiva alelo-específica a nivel de
población (Neumann y cols., 2006).
Se ha observado que las respuestas de células T
CD8+ dirigidas contra mutantes de escape
inmunológico en chimpancés, se relacionan con una
disminución de la diversidad de receptores de
células T (TCR, del inglés T Cell Receptor)
comparado con la respuesta contra epítopos sin
variación de secuencia (Meyer-Olson y cols., 2004).
Esta limitada diversidad del TCR estuvo presente antes de que se
detectara los mutantes de escape viral, lo cual indica que el
bajo repertorio de TCRs directamente facilita el desarrollo de
mutantes y de esta forma, la persistencia de la
infección.
Se ha establecido la existencia de clones celulares
CD3+, CD8+ y CD56+,
capaces de lisar hepatocitos autólogos y
alogénicos. La presencia del fenotipo CD56+
característico de las NK justifica la no
restricción por el complejo mayor de histocompatibilidad I
(MHC, del inlgés major complex histocompatibility)
de la actividad citolítica y llama la atención sobre la posible trascendencia de
la respuesta inmune innata en el curso de la infección y
en la patogénesis de la enfermedad. A su vez, linfocitos
CD3+, CD16+, CD56+,
fenotipo de células B y T maduras, no restringidos por el
HLA-I se encuentran en mayor proporción en pacientes
crónicos en comparación con los controles
(González-Peralta y Lau, 1995). Se supone que existe un
corto período de tiempo en que los LTC, actuando junto a
los linfocitos CD4+ y posiblemente a las NK, son
efectivos en el control antiviral; más allá de
esto, si el virus persiste, su número y función
efectora se ven afectadas (Lechner y cols.,
2000).
1.4 Secreción de
citoquinas
En relación con el patrón de citoquinas
secretadas por las células T CD4+ en el
paradigma
respuesta auxiliadora 1/ respuesta auxiliadora 2 (Th1/Th2), en
células aisladas de pacientes, tanto aquellos que
autorresolvieron la infección, como los crónicos,
se ha demostrado que esta relación varía, aunque
predomina la respuesta Th1 (Darling y Wright, 2004; Gramenzi y
cols., 2005). Sin embargo, este patrón de
secreción de citoquinas es más frecuente en
individuos que aclararon la enfermedad, sugiriendo una
asociación entre la producción de citoquinas
antivirales, como el IFN-γ, y la defensa antiviral por
activación de células T y de fagocitos (Gramenzi
y cols., 2005). Se ha visto que estas respuestas Th1
dependen de la secreción de
IFN-gy TNF-α por las
células T auxiliadoras y de IL-12 producida por
macrófagos y las células dendríticas (Esser
y cols., 2003).
Los individuos infectados por el VHC producen IL-1,
IL-2, IL-4, IL-6 e IL-10 (Tsai y cols., 1997;
Alvarado-Esquivel y cols., 1999). Además, la
mayoría de las células T que infiltran el
hígado en individuos con hepatitis C son capaces de
secretar IFN-g(Bertoletti y
cols., 1997; Alvarado-Esquivel y cols., 1999). Esta
respuesta al parecer es mayor en pacientes respondedores al
IFN-g(Alvarado-Esquivel y cols.,
1999). Los niveles séricos de TNF varían con la
severidad de la enfermedad hepática (Torre y cols.,
1994; Nelson y cols., 1997; Alvarado-Esquivel y
cols., 1999). Los niveles de IL-12 e IFN-γ
están fuertemente incrementados en pacientes infectados;
mientras que los niveles de IL-4 y IL-6 están
significativamente disminuidos (Cribier y cols., 1998). La
IL-12 que es una citoquina producida por las APC, es una
molécula clave en la regulación de la respuesta
inmune del hospedero contra la infección. Esta
interleuquina es un factor útil y probablemente
obligatorio para la generación y proliferación de
linfocitos T auxiliadores (Fan y cols., 2000).
1.5 Tratamientos
antivirales
Interferones y análogos de
nucleótidos
En la actualidad existen varios tratamientos
antivirales. Dentro de ellos el tratamiento con
interferón, ribavirina y las combinaciones probadas entre
ambos, constituyen las terapias más estudiadas y empleadas
hasta la fecha. Los interferones son citoquinas con varias
funciones entre las que se incluyen: inducción del estado antiviral en las
células blanco, inducción de la secreción de
otras citoquinas, reclutamiento
de las células de la respuesta inmune e inducción
de la diferenciación celular. La eficacia de la
terapia con IFN-α para el tratamiento de la hepatitis C
crónica está limitada por las
características de esta molécula: estabilidad
reducida, vida media corta e inmunogenicidad.
Varios estudios han mostrado las ventajas de la
modificación del IFNα-2a
de 40 kD y el IFNα-2b de 2 kD con
polietilénglicol (polímero seguro y no
tóxico utilizado en la modificación química de varias
moléculas). Se ha observado entonces: menos fluctuaciones
en las concentraciones plasmáticas, menos toxicidad,
disminución de la inmunogenicidad y antigenicidad, y
aumento de la estabilidad fisiológica y química de
ambos interferones (PEGASY ® peginterferón alfa2a (40
kDa) Monografía
Roche). En este caso, los niveles de respuesta virológica
se duplican sostenidamente con una sola dosis a la semana
(Heathcote y cols., 2000).
La ribavirina
(1-β-D-ribofuranosil-1, 2,
4-triazol-3-carboxamida) es un análogo de
nucleótidos purínicos sintetizado por primera vez
en 1970. La monoterapia con esta entidad química reduce
los niveles de ALAT, pero no reduce los niveles de ARN viral en
pacientes con hepatitis C crónica. Se ha propuesto que la
ribavirina además de tener función
inmunomoduladora, puede actuar en la inhibición de la
inosina monofosfato deshidrogenada, la enzima de la
reacción limitante en la biosíntesis de nucleótidos de
guanina. Por tanto puede actuar como un agente mutagénico
con la subsiguiente inhibición de la ARN polimerasa NS5B
(Davis y cols., 1998).
Las fluctuaciones en las concentraciones de IFN-α
observadas de una dosis a otra pueden conducir a un rebote viral,
por lo que se hace necesaria una administración frecuente de IFN-α
para alcanzar las concentraciones plasmáticas
terapéuticas efectivas del tratamiento (Lam y
cols., 1997). En la actualidad, 24 semanas de tratamiento y
800 mg de dosis de ribavirina parecen ser suficientes para
personas infectadas con el VHC del genotipo 2 y 3, mientras que
pacientes con genotipo 1 necesitan 48 semanas de tratamiento y
dosis estándar de ribavirina. Adicionalmente, el rango de
respuesta entre pacientes del genotipo 2 o 3 es dos o tres veces
mayor que el rango de respuesta en pacientes con genotipo
1 (Diago y cols.,
2001).
Recientes terapias inmunomoduladoras revelan la gran
lista de entidades químicas que se han encontrado con
efecto antiviral. Algunas con un perfil de seguridad
superior a la ribavirina y mucho más tolerada, como la
levovirina (un análogo de la ribavirina pero con
figuración L en la unión del anillo ribofuranosil y
el heterociclo triazol) (Rossi y cols., 2001). Otras
aún en estudios clínicos, como son: la viramidina
(Gish, 2006), el merimepodib (VX-497)(McHutchison y cols.,
2005), la timosina α-1 (ZADAXIN) (Billich, 2002), la
amantadita (Chan y cols., 2002), el mofetil micofenolato (Herrine
y cols., 2005), el espectro de análogos de
nucleósidos ZX-2401 (Ojwang y cols., 2005),
agonistas de los TLR7 (del inglés, Toll Like
Receptor) (Horsmans y cols., 2005), del TLR9
(McHutchison y cols., 2005) y del TLR7/8 (Pockros y
cols., 2003).
Inhibidores de proteasas
Otras variantes antivirales en estudio incluyen
inhibidores de la serín-proteasa NS3/NS4, de la ARN
polimerasa NS5B, del sitio de reconocimiento
ribosomal y de los factores de replicación del
hospedero. Dentro de las variante de los inhibidores
de la serín proteasa se encuentran varios péptidos
miméticos como son: el BILN 2061, el SCH 503034 y el
VX-950 que en mayor o menor grado reducen los niveles de ARN
viral y de las aminotransferasas hepáticas (Hinrichsen
y cols., 2004; Zeuzem y cols., 2005; Reesink y
cols., 2006). Entre los inhibidores de la ARN polimerasa se
han estudiado el análogo de nucleósido R1479
y la valopicitabina (NM-283) (Klumpp y cols., 2005).
Entre los inhibidores de los factores de replicación del
hospedero se encuentran la lovastatina, una droga capaz de
inhibir la prenilación de la proteína FBL2
requerida para el ensamblaje del complejo de replicación
(Wang y cols., 2005), y la ciclosporina un inhibidor de la
ciclofilina B (CyPB), una peptidil-prolil cis-trans isomerasa que
se une a la polimerasa viral y es capaz de potenciar la
replicación (Watashi y cols., 2005).
Recientemente una molécula apoptótica modificada
fue desarrollada específicamente para eliminar las
células infectadas. Una molécula precursora, creada
para albergar un sitio de clivaje NS3 serín-proteasa,
libera la proteína pro-apoptótica BIP
después del procesamiento proteolítico en
células que expresan el complejo VHC NS3-4. La observación de que la serín-proteasa
NS3 puede clivar sustratos extraños in trans es
bastante poco esperada y levanta perspectivas interesantes para
la eliminación específica de las células
infectadas con HCV como nueva estrategia
antiviral (Brass y cols., 2004).
Ribozimas y oligonucleótidos de polaridad
negativa
Las ribozimas son pequeñas moléculas de
ARN con actividad endorribonucleasa intrínseca. La
especificidad de estas moléculas de debe a la presencia de
secuencias complementarias que flanquean el sitio activo. En
contraste, los oligonucleótidos de polaridad negativa
requieren la ARNasaH de la célula
del huésped para mediar la ruptura de la secuencia blanco
complementaria. Modificaciones químicas de las ribozimas y
los oligonucleótidos previenen su degradación por
nucleasas celulares. El sitio de reconocimiento ribosomal (IRES,
del inglés Internal Ribosomal Entry Site) altamente
conservado dentro de la región no traducida del extremo
5´ del genoma del VHC, representa un blanco atractivo para
las estrategias de
ruptura de secuencias específicas. Un efecto inhibitorio
de las ribozimas dirigidas al IRES del VHC ha sido demostrado en
un sistema quimera VHC-poliovirus, sin embargo los resultados no
son muy alentadores y conllevan a efectos adversos (Brass y
cols., 2004).
Varios oligonucleótidos dirigidos al IRES han
sido mostrados para inhibir la iniciación de la
traducción en el sistema libre de células, en
experimentos en cultivos celulares y en un modelo de
animal pequeño. Reportes recientes afirman que
un fosfotioato-oligodeoxinucleótido de polaridad
negativa (ISIS-14803) capaz de inhibir la biosíntesis de
proteínas brindando resultados
prometedores. (McHutchison y cols.,
2006).
ARN de interferencia
Los ARN pequeños de interferencia (siRNA, del
inglés small interfering Ribonucleic Acid) son
pequeñas moléculas doble cadena que median la
degradación de secuencias específicas de RNA
monocatenario y resulta en un "knock down" (disminución)
de la codificación del producto
génico. Este proceso
post-transcripcional silenciado es importante para varias
funciones celulares como por ejemplo la protección contra
virus y transposones en plantas e
insectos. Varios estudios han mostrado recientemente que la
replicación del ARN del VHC puede ser eficientemente
inhibida por siRNA en el sistema replicón. La
aplicabilidad clínica de esta propuesta dependerá
de la eficiente liberación y estabilidad del
siRNA.
Se han reportado estudios de ARN de
interferencia contra los genes de la ARN polimerasa, del core,
E2, NS3 y NS5A (Prabhu y cols., 2005). Así mismo se
han ensayado ARN de interferencia dirigidos contra los genes de
los cofactores de replicación del hospedero alfa-subunidad
7 de proteosoma y el Hu antígeno R (Korf y cols.,
2005)
1.6 Estrategias vacunales contra el
virus la Hepatitis C
La infección aguda no es considerada un problema
de salud a nivel
mundial a diferencia de la infección crónica
(Abrignani, 1999), por lo tanto, la meta
más realista si bien es buscar una vacuna que prevenga la
infección, es buscar además una formulación
que evite la progresión a la cronicidad. En la
búsqueda de una vacuna efectiva frente al VHC se han
estudiado disímiles estrategias: subunidades proteicas,
partículas semejantes a virus, vacunas
peptídicas, vectores
virales recombinantes y vacunas de ADN.
En el enfoque de vacunas de subunidades se han empleado
fundamentalmente las proteínas estructurales,
llegándose a evaluar varias combinaciones en
chimpancés. Se tienen evidencias preliminares, de que una
vacuna constituida por el heterodímero formado por las
glicoproteínas recombinantes de la envoltura del VHC (E1 y
E2/p7) (Choo y cols., 1994), puede generar respuestas de
Acs y de células T CD4+. Se demostró
que ambas respuestas pueden prevenir la cronicidad en
chimpancés, aunque solo específica
para el aislamiento viral homólogo.
También se ha logrado la protección total frente al
reto homólogo en chimpancés luego de la
inmunización de los mismos con las proteínas E1 y
E2 junto a péptidos sintéticos de la RHV 1 (Goto
y cols., 2001).
Por ser la más conservada entre todas las
proteínas del VHC, la proteína de la cápsida
es un candidato promisorio para la inducción de la
protección contra la infección por este virus. En
un esquema de inmunización en macados, se inoculó
esta proteína adyuvada con formulaciones no
clásicas de ISCOM (complejos inmunoestimuladores)
obteniéndose fuertes respuestas CD4+ y
CD8+, así como respuestas humorales
satisfactorias (Polakos y cols., 2001). Una variante de
esta proteína, truncada hasta el aminoácido 120,
obtenida en Escherichia coli (E. coli) (Lorenzo
y cols., 2000), ha mostrado su inmunogenicidad,
obteniéndose en ratones BALB/c títulos de 1:100000
y un perfil de secreción de citoquinas indicativo de la
inducción de una respuesta celular (Alvarez-Obregón
y cols., 2001).
Una variante que incluyó a la proteína E1
truncada en el extremo C-terminal adyuvada en hidróxido de
aluminio, ha
sido probada en 19 pacientes con infección crónica.
Los resultados mostraron una mejoría histológica,
un aumento en los títulos de anticuerpos anti-E1 en todos
los pacientes y respuestas linfoproliferativas aproximadamente
entre el 90 y el 100% de los individuos, aunque no se obtuvo
reducción de los títulos de ARN viral (Nevens y
cols., 2003). En el subsiguiente tratamiento en Fase II
probado en 35 pacientes incluyendo un grupo placebo,
se demostró la seroconversión contra E1 en todos
los pacientes y la inducción de una respuesta
proliferativa de células T en el 88 % de los casos
después de la sexta dosis, lo cual no fue suficiente para
la disminución sostenida de la carga viral.
El enfoque de partículas semejantes a virus ha
sido probado en ratones (Lechmann y cols., 2001)
obteniéndose respuestas celulares y humorales que abogan
por la potencialidad de este tipo de candidatos vacunales. En
ratones también se han generado respuestas inmunes contra
la cápsida, E2 y las proteínas no estructurales
luego de la inmunización con péptidos (Hiranuma
y cols., 1999).
Recientemente una vacuna peptídica (IC41) basada
en cinco péptidos sintéticos del VHC que incluyen
epítopos de células T y que utiliza el adyuvante
sintético constituido por poly-L-argininas, ha demostrado
ser segura en 128 individuos sanos (HLA-A2+) y
capaz de inducir una respuesta de linfocitos T
CD4+ y CD8+ secretora de
IFN-γ (Christa Firbas y cols., 2006).
Una estrategia novedosa, estudiada en la actualidad por
muchos laboratorios, es la vacunación terapéutica
con células dendríticas. La estimulación
ex vivo y la maduración de las células
dendríticas en presencia de la proteína core y
algunos péptidos o de la NS3, indujo una potente respuesta
tanto humoral como celular en ratones (Encke y cols.,
2005; Yu y cols., 2006). A su vez, otros experimentos se
han llevado a cabo en los que fue transferido un vector
adenoviral, que contenía los genes que codifican para la
proteína core y la NS3, a células
dendríticas aisladas de pacientes sanos o pacientes que
aclararon la infección. Esta estrategia indujo altos
índices de respuestas tanto de anticuerpos como de
células en ratones (Li y cols., 2006).
Estudios pre-clínicos en ratones, mostraron que
la inmunización con una levadura recombinante
(Saccharomyces cerevisiae) que expresa la proteína
de fusión
NS3-Core (GI-5005), era capaz de inducir una
linfoproliferación VHC-específica así como
una respuesta LTC asociado a un patrón Th1de
secreción de citoquinas. Después de que la
administración terapeútica demostrara su
capacidad de erradicar células tumorales que expresaban
NS3 en ratones, comenzó un estudio clínico fase I
en pacientes crónicos (Haller y cols.,
2007).
1.7 Aplicación de la
inmunización con ADN en el desarrollo de vacunas contra el
VHC
Varios estudios dan fe de la utilidad de la
inmunización con plasmidios como estrategia para expresar
endógenamente proteínas no propias al organismo, y
desencadenar respuestas inmunitarias contra los mismos. Se ha
demostrado que esta tecnología puede
inducir una respuesta tanto celular como humoral en varios
modelos animales, siendo esto una estrategia atractiva para el
desarrollo de una vacuna contra el VHC (Dueñas-Carrera,
2004).
La implementación de una vacuna efectiva en
modelos animales depende en gran medida de la habilidad de
estimular la respuesta de células T restringida al HLA
(Dueñas-Carrera, 2004). Con el objetivo de
potenciar aun más la repuesta inmune se ha probado mezclar
el ADN con diferentes aditivos. En varios casos se ha utilizado
el binomio ADN-proteínas recombinantes, ya sea inmunizando
en un régimen de sensibilización con ADN y dosis de
recuerdo con la proteína o con ambos compuestos
simultáneamente. Particularmente, se ha obtenido un
incremento de IgG2a y de la respuesta de células T
CD8+ al evaluar el efecto de la mezcla E2-ADN,
respecto al uso de ambos componentes por separado, en ratones
(Song y cols., 2000). Por otro lado, se ha experimentado
que la inmunización con una mezcla en la que se combina
una variante de la proteína core truncada hasta el
aminoácido 120, con un plasmidio que codifica los primeros
650 aminoácidos de la poliproteína del aislamiento
viral cubano, genotipo 1b, induce una potente respuesta humoral y
celular. Estas respuestas fueron capaces de proteger frente al
reto en ratones con virus vaccinia recombinante que expresa la
proteína core (Alvarez-Lajonchere y cols.,
2006).
Recientemente, dos chimpancés
vírgenes fueron inmunizados aplicando dosis de
sensibilización con ADN y dosis de recuerdo con las
proteínas estructurales del VHC (Core, E1 y E2),
así como, con la proteína no estructural NS3 y
posteriormente expuestos al subtipo 1b (heterólogo) del
VHC J4. Resultó que uno de los chimpancés
resolvió rápidamente la infección, mientras
que el otro la controló sin problemas
(Rollier y cols., 2004). Aunque la vacunación
indujo Acs,
IFN-gpéptido-específico,
respuestas linfoproliferativas
proteino-específicas y respuesta
de células CD4+ en ambos animales, las
especificidades fueron marcadamente diferentes. El
chimpancé que aclaró rápidamente la
infección por el VHC desarrolló respuestas que
fueron menores en magnitud, pero dirigidas hacia un
patrón de respuesta de citoquinas tipo Th1 para E1 y NS3.
Fue observado que la producción de
IFN-g
específico para E1 y NS3
por células T en estadíos
tempranos de la infección, puede ser clave para la
inducción de inmunidad protectora por vacunación.
Además se hace extensivo el papel de una fuerte respuesta
tipo Th1 en la inmunidad inducida por una vacuna
profiláctica contra el VHC.
La inmunización conjunta de plásmidos que
expresan Ags estructurales y plásmidos que expresan Ags no
estructurales del VHC; ha confirmado que la inmunidad inducida
por inmunización con ADN a pesar de desarrollarse
lentamente, alcanza importantes niveles (Pancholi y
cols., 2003). Los Acs y la respuesta celular contra
NS3 no es frecuentemente encontrada en pacientes
crónicamente infectados pero sí se ha observado en
pacientes con infección aguda autolimitada y pacientes
sanos que se caracterizan por una protección esterilizante
(Isaguliants y cols., 2003).
Otra variante muy estudiada en la vacunación con
ácidos
nucleicos es la co-inmunización con plásmidos que
expresan citoquinas, así como las estrategias de
sensibilización/recuerdo. Ambas vertientes han sido
evaluadas para aumentar la respuesta inmune específica
contra las proteínas del VHC (Dueñas-Carrera,
2004). En estudios recientes se ha observado que la interleuquina
23 (IL-23) induce una duradera respuesta de CTL y Th1 contra E2
después de la vacunación con un plásmido que
expresa esta proteína. La inmunidad mediada por esta
citoquina fue mucho más potente que la respuesta mediada
por la IL-12. La IL-23 posee actividad biológica similar a
la IL-12, pero se diferencia en la capacidad de estimular
células T memorias in
vitro (Ha y cols., 2004). Otras citoquinas tales como
la IL-18 han sido recientemente probadas y demostrado su efecto
adyuvante en la vacunación con ADN (Lee y
cols., 2003).
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