PCR en tiempo real: la nueva era de la información genética (página 2)

La PCR en tiempo real
puede generar amplicones muy pequeños (desde 60 pb) lo que
la hace ideal para la detección de cambios cuantitativos
en la expresión génica durante el curso de
alteraciones celulares patológicas o experimentales,
así como para la cuantificación de niveles de ARNm
en muestras de tejidos con ARN
parcialmente degradado (Bustin, 2002).

Una característica importante de PCR en tiempo real es
su amplio rango dinámico. Esto implica que una amplia gama
de ratios en los genes a estudiarse y en los genes normalizadores
puede analizarse con similar sensibilidad y especificidad (Dorak,
2008).

En esta prueba el producto de la
PCR se mide al final de cada ciclo. Los datos pueden ser
analizados mediante un software informático
y el número de copias de ARNm o la expresión
génica relativa entre varias muestras puede calcularse
(Heid et al.,  1996).

2 Transcripción
reversa en la PCR en tiempo real

Una limitación de la PCR en tiempo real es que se debe
utilizar ADN como
secuencia diana, ya que las ADN polimerasas no pueden amplificar
ARN de una manera similar. Este problema se puede superar
mediante el uso de la enzima transcriptasa inversa para generar
ADNc a partir de una plantilla de ARN (Valasek & Repa,
2005).

Hay varias transcriptasas inversas utilizadas
comúnmente, entre ellas tenemos la transcriptasa inversa
del virus aviar de
mioblastosis la y la transcriptasa inversa del  virus de
leucemia murina, siendo la primera la más robusta de
ellas. También es posible usar mezclas de
transcriptasas inversas, pudiendo estas dar lugar a una mejor
eficiencia de
la transcripción inversa que las enzimas de
componente individual (Bustin, 2005b).

Por esta razón la PCR en tiempo real con transcriptasa
inversa (RT-PCR en tiempo real) se ha convertido en el método de
elección para realizar un examen rápido y
cuantitativo de la expresión de genes específicos,
lo que no sería posible con anteriores metodologías
(Walker, 2002)

Por último, es importante mencionar que dado que la PCR
en tiempo real y la transcripción reversa se utilizan en
combinación, la señal final obtenida en RT-PCR en
tiempo real dependerá de la eficiencia de la
reacción de la transcriptasa inversa (Bustin et
al.,  2005).

3 Marcadores
Fluorescentes

Varios métodos se
han desarrollado para cuantificar el producto de la PCR. Sin
embargo la PCR se ha aplicado principalmente como un
método cualitativo, ya que para llevar a cabo la
cuantificación en los productos de
estas reacciones se necesita mucho tiempo y los métodos
para realizarla son relativamente difíciles de
implementar. Además debe tenerse en cuenta que en los
últimos ciclos de la reacción de la PCR, la
cantidad de producto no guarda relación con la cantidad
inicial de ADN o ADNc en las muestras a analizarse (Lee et
al.,  2004; Valasek & Repa, 2005).

Por el contrario y en contraste con los métodos
anteriores en los que se necesitan componentes adicionales, una
de las más importantes ventajas de la PCR en tiempo real
es que el proceso
completo se realiza en el termociclador. Esta
característica ayuda a disminuir el riesgo de
posterior contaminación en el laboratorio y
permite aumentar el rendimiento de la prueba en tiempo real
(Valasek & Repa, 2005). Para obtener estos resultados, este
sistema incluye
dos componentes: elementos ópticos integrados al
termociclador (figura 1) y  marcadores fluorescentes que
proporcionan información acerca de amplificación
a lo largo de los ciclos de la PCR (Heid et al.,
 1996).

Figura 1

Componentes ópticos en el termociclador que
permiten  la identificación de marcadores
fluorescentes.

Hay dos clases principales de marcadores fluorescentes para la
PCR en tiempo real: genéricos y específicos. Las
técnicas que usan marcadores fluorescentes
específicos emplean sondas de ácidos
nucleídos que se unen a amplicones específicos
(producto de PCR). Los métodos que utilizan sondas
fluorescentes tienen la ventaja de ser muy precisos y evitar
posibles artefactos o secuencias inespecíficas presentes
en el producto de la PCR. Sin embargo, este enfoque necesita de
un diseño
de secuencias específicas para su uso como sondas y por
consiguiente es más laborioso y costoso (Lee et
al.,  2004).

La detección genérica se basa en la
utilización de colorantes que se unen a todas las
secuencias de doble cadena de ADN en una reacción de PCR
(figura 2). Una vez que el colorante se une al ácido
nucleído formado en la reacción, este emite una
señal fluorescente que se procesa en tiempo real (Walker,
2002). Por lo tanto, un aumento del producto de la PCR conduce a
un aumento de la fluorescencia detectada en cada ciclo de la PCR;
esto permite que las concentraciones de ADN o ADNc puedan ser
cuantificadas (Ririe et al.,  1997).

Varios de estos marcadores se han descrito pero los más
utilizados son los colorantes SYBR ® Green y SYBR ® Gold
(Lee et al.,  2004). Estos marcadores son populares
para su uso en la PCR en tiempo real porque no sólo son
más baratos sino que también son distribuidos por
los proveedores de
reactivos como cócteles listos para usar y no requieren un
diseño experimental adicional (Ririe et al.,
 1997; Giglio et al.,  2003).

La principal limitación de estos marcadores es que al
unirse al total de ácidos nucleídos en la
reacción de la PCR, emiten una señal luminosa tanto
para productos específicos como para aquellos que no lo
son (primer-dimers). Para hacer frente a esta situación se
debe realizar un análisis de los resultados en la curva de
fusión
(Melt Curve). Este análisis permite que los productos no
específicos puedan ser discriminados de los amplicones
específicos (Ririe et al.,  1997).

Figura 2

Los marcadores fluorescentes genéricos en la PCR en
tiempo real emiten una señal luminosa para todas las
secuencias de doble cadena. Esta señal luminosa puede ser
medida posteriormente.

4 Análisis de la
curva de fusión

Los datos que se obtienen con diferentes mezclas de SYBR ®
Green (cócteles comerciales o mezclas realizadas en
laboratorio) pueden variar. Sin embargo se observa constantemente
que los amplicones detectados con SYBR ® Green I son
significativamente grandes y tienen un alto contenido de GC
(Giglio et al.,  2003). En consecuencia es posible
identificar productos específicos de la PCR mediante el
análisis de la temperatura de
fusión que se expresa en una curva cuya forma se relaciona
con el contenido de GC, tamaño de los amplicones y la
secuencia de los mismos (Ririe et al.,  1997).

El análisis de la curva de fusión puede llevarse
a cabo en la mayoría de plataformas disponibles para la
PCR en tiempo real, por lo general al final de la reacción
de amplificación. La  medida de la fluorescencia
dependiente de la temperatura se realiza mientras la temperatura
en el termociclador aumenta de alrededor de 50°C a 95°C,
siendo la fluorescencia detectada dependiente de la presencia de
secuencias de doble cadena de ADN o ADNc (Giglio et al.,
 2003; Lee et al.,  2004).

Cuando las dobles cadenas de ADN o ADNc se separan por efectos
de la temperatura, la fluorescencia disminuye porque el colorante
deja de estar unido al producto de la PCR. La mayoría de
los instrumentos proporcionan un análisis de estos datos
teniendo en cuenta el punto en donde aparece el primer
diferencial negativo de la señal de fluorescencia con
respecto a la temperatura y la temperatura de fusión
(figura 3). Este punto aparece como uno o más picos que
representan las temperaturas a las que los máximos niveles
de cambio de la
fluorescencia se producen, correspondiendo estos a un producto
particular en la PCR (Lee et al.,  2004).

Para discriminar los productos específicos de la PCR es
necesario saber que estos se disocian a una temperatura
más alta que los artefactos como primers dimers
 (Ririe et al.,  1997).

Figura 3

Análisis de la curva de fusión. Los picos de las
curvas muestran que los productos específicos de la PCR en
tiempo real tienen una temperatura de fusión mayor a la de
productos inespecíficos.

Vale la pena tener en cuenta que el método de
análisis de la curva de fusión es análogo al
de electroforesis en gel de agarosa (Giglio et al.,
 2003). Con ambos métodos se puede evidenciar la
presencia de productos no específicos, sin embargo
también están expuestos a errores. Estos casos
ocurren cuando las masas moleculares de los productos de la PCR
en cuestión son similares. Adicionalmente, la exactitud de
estos datos depende también de las plataformas de hardware utilizadas (Lee
et al.,  2004).

5 Umbral y
valores umbral
del ciclo (threshold cycle values)

Como se ha descrito, los resultados de la PCR en tiempo real
se basan en la detección y cuantificación de los
marcadores fluorescentes a lo largo de la reacción de la
PCR. Esto permite conocer la cantidad de fluorescencia emitida
durante la fase exponencial de la reacción, donde un
aumento significativo del producto de la PCR se correlaciona con
la cantidad inicial de ADN o ADNc en estudio (Walker, 2002).

Para obtener estos resultados, los valores
umbral de ciclo (Ct por sus siglas en ingles) deben ser
obtenidos. Anteriormente, un umbral adecuado debe ser fijado por
el operador en un punto significativamente por encima de la
línea base (Figura 4). Los valores Ct son determinados por
la identificación del ciclo en el cual la emisión
de la intensidad del marcador fluorescente se eleva por encima
del ruido de fondo
en la fase exponencial de la reacción de la PCR (Figura
5). En otras palabras, el valor Ct
está representado por el ciclo en el cual la producción de fluorescencia cruza el umbral
establecido (Bustin, 2005a).

Es importante considerar que un valor Ct superior a 40 ciclos
indica que no hay amplificación y por consiguiente no
deben incluirse en los cálculos. En la actualidad hay
software que puede determinar valores Ct mediante un análisis
matemático de la curva de crecimiento pudiendo tener
así una mejor reproducibilidad en las pruebas de PCR
en tiempo real (Dorak, 2008)

Figura 4

Umbral (threshold) fijado con anterioridad para la
determinación de los valores Ct.

Gráfico 5

Los números de ciclo en los cuales la curva de
fluorescencia atraviesa el umbral establecido corresponden a los
valores Ct que se utilizarán en cálculos
posteriores.

6 Optimización de PCR
en tiempo real

Para obtener resultados confiables en las pruebas realizadas
con la PCR en tiempo real es necesario optimizar la
reacción en el laboratorio. La optimización
consiste en hacer que las variaciones normales de la prueba no
causen efectos importantes en los valores Ct y que tengan un
impacto mínimo en la cantidad de fluorescencia observada.
Los criterios más importantes para la optimización
son especificidad, sensibilidad, eficiencia y reproducibilidad de
la PCR en tiempo real (Edwards, 2004).

Los factores que deben ser optimizados son las mezclas
maestras de reactivos, la concentración de los primers,
concentración de los marcadores fluorescentes y la
concentración de la muestra. Las
mejores concentraciones de reactivos y condiciones de la PCR son
aquellas en las que se observa resultados óptimos en
términos de la curva de fusión y de la eficiencia
de la amplificación en reacciones llevadas a cabo con
controles positivos o calibradores (Edwards, 2004).

También es útil realizar electroforesis en gel
de agarosa cuando se optimiza una PCR en tiempo real. Los
resultados de este análisis proporcionan datos para
relacionar la longitud del producto con los picos del
análisis de la curva de fusión y la posible
presencia de artefactos como primer dimmers (Dussault &
Pouliot, 2006).

7 Estrategias para
la cuantificación de ARNm en PCR en tiempo real

Comúnmente se emplean dos estrategias para llevar a
cabo la cuantificación de la expresión genética
con PCR en tiempo real. Estas estrategias son:
cuantificación absoluta y cuantificación relativa
de la PCR en tiempo real.

7.1 Cuantificación absoluta

La técnica de cuantificación absoluta relaciona
la señal obtenida con la PCR en tiempo real al
número de copias fijo de una secuencia estándar
utilizando una curva de calibración. Las curvas de
calibración son altamente reproducibles y permiten la
generación de datos específicos y sensibles. Sin
embargo el modelo de
curvas de calibración externas tiene que ser rigurosamente
validado con absoluta exactitud pues la cuantificación de
la expresión genética en la PCR en tiempo real
depende exclusivamente de la precisión de los
estándares empleados (Pfaffl, 2008).

Además, el diseño de secuencias estándar,
su producción y la determinación exacta de sus
concentraciones así como su estabilidad a largo plazo y su
almacenamiento
son factores complejos y puede presentar algunos problemas
(Pfaffl, 2004). Estas consideraciones hacen de la
cuantificación absoluta un procedimiento
laborioso, costoso y que no siempre pueden llevarse a cabo en
todos los laboratorios.

7.2 Cuantificación relativa

La cuantificación relativa no requiere
estándares con concentraciones determinadas. Esta
técnica se utiliza para obtener la magnitud de los cambios
fisiológicos en los niveles de expresión
genética de un gene en estudio en comparación con
uno o más  genes de referencia (Pfaffl, 2004). Hay
que tomar en cuenta que la expresión de los genes de
referencia debe ser constante en las células
estudiadas. Por esto, las secuencias utilizadas para
cuantificación relativa son generalmente genes
"housekeeping" (Ambion, 2008).

Los cálculos en cuantificación relativa de
expresión genética se basan en la
comparación de los valores Ct utilizando la eficiencia de
la reacción de la PCR como factor de corrección.
Sin embargo, hay un modelo que no requiere la eficiencia de la
reacción para acceder a un factor de corrección.
Este modelo supone una eficiencia óptima e idéntica
(correspondiente al 100%) en la eficiencia de reacción en
las PCR en tiempo real tanto del gen en estudio como del gen de
referencia (Livak & Schmittgen, 2001). Este es el
método 2 delta-delta Ct  que sólo es aplicable
para una estimación rápida de la proporción
relativa de la expresión genética en estudio
(Pfaffl, 2001). El método 2 delta-delta Ct expresa la
proporción obtenida de la relación entre los
valores Ct de la muestra y los valores Ct del control tal y
como se muestra en la siguiente ecuación:

Otro modelo para cuantificación relativa ha sido
publicado por Pfaffl (2001). En este modelo las diferentes
eficiencias de la PCR tanto para los genes en estudio como para
los genes de referencia se toman en cuenta como se muestra en la
siguiente ecuación:

En esta ecuación el ratio del gen en estudio se expresa
en una muestra frente a un control en comparación con un
gen de referencia. Etarget representa la eficiencia de
la PCR en tiempo real del amplicon en estudio; Eref
representa la eficiencia de la PCR en tiempo real del gene de
referencia; ΔCPtarget  es la
desviación en Ct del control menos la muestra del gene en
estudio; y ΔCPref es la desviación en Ct del control
menos la muestra del gen de referencia.

Como se mencionó, en este modelo también es
necesario conocer la eficiencia de PCR de cada gen estudiado. Las
eficiencias de la PCR en tiempo real se calculan a partir de las
pendientes de la curva estándar obtenidas después
de realizar diluciones seriadas con las reacciones de la PCR en
tiempo real (Pfaffl, 2004) de acuerdo a la siguiente
fórmula:

E=10[-1/slope]-1.

Es importante mencionar que la eficiencia de la PCR en tiempo
real es la capacidad de la reacción de duplicar el
número de copias de las cadenas de ADN o ADNc en cada
ciclo (Bustin & Nolan, 2004a)

Se ha observado que la cuantificación relativa de ARNm
tiene algunas limitaciones. En primer lugar, se puede introducir
un sesgo estadístico importante cuando hay grandes
diferencias en los niveles de expresión del gen en estudio
y del gen normalizador lo que pueden conducir a una interpretación biológica equivocada
y en segundo lugar, es difícil encontrar genes de
referencia adecuados (Bustin et al.,  2005). Por
estas razones es recomendable la utilización de más
de un gen de referencia con el fin de tener datos fiables en
la
investigación (Bustin & Nolan, 2004b).

8 Genes de
referencia

Algunos de los genes de referencia más utilizados
incluyen: β-actina, Glyceraldehyde 3-fosfato deshidrogenasa,
hipoxantina guanina phosphoribosyl-transferasa y 18S del RNA
ribosomal (Huggett et al.,  2005).

La elección correcta de los genes de referencia para la
normalización de PCR en tiempo real es
esencial para reflejar datos fiables sobre los procesos
biológicos de las proteínas
objeto de estudio (Robinson et al.,  2007).
Además se ha demostrado que el uso de un solo gen
como  gen de referencia es susceptible a tener errores en la
interpretación de los resultados de la PCR en tiempo real
(Lee et al.,  2002). En consecuencia, para normalizar
las expresiones de genes cuando se trabaja con PCR en tiempo
real, es necesario utilizar más de un gen de referencia,
sobre todo cuando no se puede encontrar un único gen de
referencia con características óptimas para
realizar cuantificación relativa (Huggett et al.,
 2005; Robinson et al.,  2007)

Actualmente existe software adecuado para realizar el
análisis de la idoneidad se genes de referencia para cada
experimento que se realice y pueden ser encontrados de forma
libre en internet. Un ejemplo es
BestKeeper con el cual se puede acceder a la
calificación de hasta 10 genes de referencia y puede ser
descargado de http://www.gene-quantification.info/.

9 Aplicaciones de la
PCR en tiempo real.

La PCR en tiempo real tiene amplias aplicaciones en investigación científica y como
herramienta de diagnóstico. Vale la pena resaltar que se
han hecho grandes logros en el estudio de virus que afectan al
hombre y a los
animales
(Bustin, 2005a) así como en la investigación de bacterias y
hongos
patogénicos, pues esta prueba ofrece una gran sensibilidad
y especificidad en menor tiempo y a un menor costo.
También es ampliamente utilizada en identificar mutaciones
o polimorfismos genéticos valiéndose de sondas
específicas y sus resultados en el análisis de los
cambios de la curva de fusión (Valasek & Repa, 2005).
Asimismo la PCR en tiempo real se utiliza para acceder a datos
relevantes a la biodinámica de los organismos que producen
enfermedades
(Clementi et al.,  1993).

Sin embargo uno de los campos de mayor aplicación de
esta técnica es la investigación de cambios en la
expresión genética de células a
través de la cuantificación de su ARNm, permitiendo
asociar dichos cambios a estados fisiológicos celulares,
presencia de fármacos, agentes infecciosos, etc (Bustin
et al.,  2005).

Una ventaja adicional de esta técnica es que para
implementarla es suficiente contar con una cantidad
pequeña de muestra. Esto la hace ideal cuando se usa
conjuntamente con microcirugía laser para hacer
biopsias de tejidos o células específicas y
estudiar, por ejemplo, el comportamiento
de células cancerosas (Edwards et al.,  2004;
Johnson et al.,  2005).

La PCR en tiempo real también se está usando en
otros campos como la investigación forense y la
bioseguridad. En estos casos las investigaciones
se basan en la identificación con una alta sensibilidad y
especificidad de organismos patógenos o saprófitos
difundidos en el medio ambiente. La
caracterización de pequeñas cantidades de material
genético procedente de tales organismos hace posible
conocer su procedencia e identificar su dinámica (Johnson et al.,
 2005).

Otro campo en el que se utiliza la PCR en tiempo real es el de
la seguridad
alimentaria. Aquí, la identificación de organismos
genéticamente modificados (OGM) en alimentos o
aditivos alimentarios es una necesidad que se puede cubrir
utilizando esta tecnología. Bajo los
principios
revisados anteriormente también se puede acceder a la
cuantificación de OGM, recurriendo a genes de referencia
para normalizar la cantidad de ADNc ingresado en los ensayos
(Bustin, 2005a).

10 Futuras perspectivas
de la PCR en tiempo real

Uno de los usos que se desprende de la tecnología
utilizada en la PCR en tiempo real es la realización de
pruebas diagnósticas moleculares en el mismo lugar en
donde se toma la muestra a ser estudiada y no en laboratorios
lejanos. Esto no solo volvería a este tipo de
tecnologías más baratas, sino que hará que
los datos colectados sean más fáciles de procesar y
estén a disposición de los investigadores de manera
inmediata. Estas visiones, conjuntamente con el desarrollo de
plataformas de hardware portátil, darán paso al
inicio de la era de pruebas genéticas individualizadas
(Walker, 2002). La disponibilidad y facilidad de uso que se
proyectan a futuro con la PCR en tiempo real también
harán posible utilizar este tipo de plataformas en
instituciones
educativas para enseñar de forma práctica y
evidente las características e implicaciones de la
biología
molecular (Valasek & Repa, 2005).

11
Conclusión

En la actualidad, la investigación basada en
biología molecular está abriendo un inmenso
espectro de posibilidades para un mejor entendimiento de los
fenómenos biológicos que nos rodean. Las
implicaciones que tiene este nuevo conocimiento
abarcan campos tan diversos como la medicina, la
conservación medio ambiental y la industria. En
este contexto las pruebas como la PCR en tiempo real son una
prometedora ayuda para el desarrollo de aplicaciones que permitan
realizar investigación en biología molecular
obteniendo un gran flujo de datos fiables y precisos sobre los
organismos estudiados. Sin embargo mayor investigación y
desarrollo serán necesarios para hacer de esta prueba
accesible a un gran público y sus resultados interpretados
de manera directa y fiable.

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 Autor:

Christian Vinueza Burgos

2008