La fijación de embriones tiene por objeto matar las
células y conservarlas, hasta donde sea posible, en
el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es
un método histológico destinado a obtener
preparados duraderos que conservan la estructura
morfológica y química de las células y
tejidos al estado vivo y que permite realizar, posteriormente,
los procedimientos de coloración o de
identificación que facilitan el completo conocimiento de
su constitución íntima.
Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los
agentes físicos que se utilizan para tal fin.
Cualidades que debe tener un fijador:
1. Actuar con rapidez, matando y fijando a
las células antes de que aparezcan los fenómenos
agónicos o post – mortem (autolisis,
desintegración, etc.)
2. Poseer ato poder de penetración
para asegurar la fijación correcta hasta en las capas
profundas de la pieza a fijar.
3. Conservar, en lo posible, los detalles
estructurales que presentaban in vivo.
4. Permitir o favorecer el empleo de los
procedimientos necesarios para su observación ulterior
(ejecución de cortes, colorantes, etc.)
5. Impedir la desaparición de los
elementos solubles durante la fijación o después de
ella.
6. No provocar o impedir la
producción de estructuras artificiales.
7. No retraer excesivamente los tejidos ni
volverlos friables o quebradizos.
Manera de actuar de los fijadores
Varia con la composición o naturaleza de los mismos:
coagulando las proteínas sin combinarse con ellas
(alcohol, ácido pícrico, yodo, calor), formando
combinaciones químicas con las sustancias orgánicas
(ácido crómico y sus sales), o reducciones en
contacto con las mismas y originando en su seno precipitado
sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de
mercurio, cloruro de oro).
La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes,
favoreciendo así la coloración ulterior de los
tejidos (recuérdese que éstos, en su
mayoría, son reductores que muchos colorantes se
transforman en leucobases incoloras al combinar una
molécula de hidrógeno con su cromóforo)
Fijadores Químicos
Son los más utilizando; pueden ser fijadores simples,
constituidos por una sola sustancia química, y fijadores
compuestos o mezclas fijadores cuando varias sustancias
intervienen en su constitución.
1. Fijadores
Simples
a) Formol al 10%, es el más
usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se
disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata
de fijar órganos o tejidos para estudios
embriológicos topográficos.
b) Alcohol etílico absoluto o de
96%, se usa generalmente en microquímica.
c) Alcohol metílico, se lo
emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre,
médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de
punción, etc)
d) Acido ósmico al 1 ó 2
%, es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien
estructuras celulares.
e) Bicromato de potasio al 3 –
5%.
2. Fijadores
Compuestos
En su composición intervienen un número variable
de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de
completar la acción de cada uno o atenuar sus
defectos.
a) Líquido de Fleming, mezcla
cromo – osmio – acética.
b) Líquido de Zenker, mezcla
bicromato – sublimado – acética.
c) Líquido de Helly, mezcla
Zenker – formol
d) Líquido de Bouin, mezcla
picro – formos – acética.
e) Líquido de Duboscq –
Brasil, o Bouin alcohólico.
Fijadores Físicos
1. Disecación
2. Calor Seco
3. Calor húmedo
4. Frío
5. Congelación y
desecación.
2.3
HISTOQUÍMICA
La histoquímica es la técnica para
localizar sustancias químicas específicas o sitios
de actividad química en las estructuras
morfológicas que se han perturbado lo mínimo
posible. Por lo general se congela inmediatamente el tejido o
embrión en nitrógeno líquido y se secciona
con un micrótomo especial de baja temperatura que recibe
el nombre de criostato. A se coloca el tejido en un
portaobjetos de vidrio y se somete a una reacción
química específica que conduce a la
deposición de un producto coloreado en el sitio de la
actividad enzimática o en el lugar en donde se concentran
ciertas moléculas. En algunos casos es posible obtener una
solución muy detallada de las reacciones
histoquímicas en los microscopios electrónicos. Una
desventaja de la histoquímica a nivel del microscopio de
luz es que las técnicas de teñido no suelen mostrar
con gran claridad los rasgos estructurales específicos del
embrión u órgano.
Para llevar a cabo la observación histoquímica
han de plantearse una serie de operaciones destinadas a la
obtención de preparaciones de tejido, fijadas y
susceptibles de ser apreciadas con nitidez al microscopio. En tal
contexto se diferencian técnicas tales como la
microdisección, la preparación de secciones
aplicadas al análisis y al control de perdurabilidad del
tejido con un instrumento específico de corte
microscópico llamado microtomo, o la sedimentación
fraccionada de preparados homogeneizados.
El hecho de que la experimentación histoquímica
haya de realizarse necesariamente al microscopio, hace que
sólo sean válidos en su ámbito aquellos
métodos de análisis químico que induzcan en
las sustancias objeto de estudio una serie de propiedades
ópticas o que puedan registrarse fotográficamente.
Tal es el caso de las técnicas colorimétricas, las
de fluorescencia o las de medición de radiación.
Por cuanto se refiere a la fijación de las preparaciones,
entre las diversas modalidades a las que se recurre, cabe
reseñar el uso de múltiples soluciones de
fijación, la congelación de cortes
histológicos o la liofilización o
deshidratación al vacío.
2.4
AUTORRADIOGRAFÍA
Uno de los productos derivados de la era atómica ha
sido la extensa disponibilidad de isótopos radiactivos
como herramientas en las investigaciones bioquímicas. Los
precursores de las macromoléculas que contienen
átomos marcados radiactivamente pueden introducirse en un
sistema biológico y después rastrearse a
través de un ciclo metabólico por diversos medios
analíticos, uno de los cuales es la llamada
autorradiografía, técnica que permite
localizar un isótopo radiactivo, al interior de las
células o tejidos, mediante técnicas semejantes a
los que se utilizan en fotografía.
Típicamente se coloca un embrión o parte de
él en una solución que contiene un
aminoácido radiactivamente marcado o un precursor de DNA o
RNA. Después de un lapso dado, se extrae el embrión
de la solución radiactiva y se secciona para analizarse en
el microscopio, pero además de los procedimientos
histológicos normales, las secciones de tejidos se cubren
con una emulsión fotográfica, conservándose
en la oscuridad durante varias semanas. Las emisiones radiactivas
del isótopo, las cuales se han incorporado a las
proteínas o ácidos nucleicos del embrión,
impiden la emulsión durante el periodo de
exposición. A continuación la emulsión se
revela, de manera muy semejante a las películas
fotográficas. Después se depositan gránulos
de plata en la emulsión sobre las células que
contienen átomos marcados para utilizarlos como
guía, con objeto de localizar las estructuras marcadas en
el microscopio.
La autorradiografía en la actualidad se emplea de
manera sistemática tanto con microscopios de luz y
electrónicos. Con las técnicas de procesamiento
común, la autorradiografía está limitada a
ubicar macromoléculas marcadas que no se disuelven al
exterior de los tejidos. Se han desarrollado técnicas
autorradiográficas más novedosas y minuciosas para
la localización de sustancias solubles como las hormonas
esteroides, que requieren la congelación inmediata de los
tejidos para a continuación secarse de forma tal que no se
lleve a cabo el desalojamiento de los compuestos solubles
marcados.
Las técnicas autorradiográficas son de gran
utilidad para ubicar sitios de actividad sintética de
ácidos nucleicos y proteínas en embriones,
así como para rastrear el movimiento de las
células, aunque no permiten el análisis directo de
sus formas químicas en los tejidos. Por ello, es muy
importante emplear moléculas precursoras correctamente
marcadas y reconocer las trampas latentes que pueden conducir a
la mala interpretación de los resultados.
Una técnica autorradiográfica que promete
acortar la distancia entre la morfología y la
biología molecular es la hibridación in
situ. Ahora que ya es posible construir en el laboratorio DNA
complementario (cDNA) para RNA específicos, los DNA
radiactivos pueden añadirse a secciones de tejidos que se
sospeche que contengan el mRNA en cuestión. En caso de que
ese RNA esté presente, el DNA marcado se hibridiza con los
nucleótidos correspondientes del RNA. Cuando el cDNA se
enlaza estrechamente al RNA, la autorradiografía se
prepara en la forma estándar, y la presencia de
gránulos de plata indica la ubicación de las
moléculas del RNA en la célula o el tejido.
2.5 RASTREO
Se han utilizado muchos tipos de marcadores para rastrear los
movimientos de las células en el embrión en
crecimiento. Algunos de los estudios clásicos de
movimientos celulares implican la aplicación de marcadores
no tóxicos a pequeños grupos de células. Los
tipos de tintes que pueden aplicarse a las células
vivientes sin dañarlas, como el sulfato azul de Nilo y el
rojo neutro, reciben el nombre de colorantes vitales. Los
cambios de posición de las células tratadas con
estos colorantes pueden seguirse durante el transcurso de un
periodo extenso de crecimiento, antes que el colorante se torne
tan difuso que resulte imposible su identificación.
Tendremos ocasión para considerar la aplicación de
dichas técnicas con relación a los movimientos
celulares en la gastrulación de anfibios. La
marcación también puede llevarse a cabo al colocar
en pequeños grupos de células partículas de
carbón fisiológicamente inerte, finamente dividido,
como las de carbón de sangre. Los resultados de
experimentos en los que participan las marcaciones de
carbón se utilizarán cuando se hable de los
movimientos celulares en la vecindad de la línea primitiva
del polluelo.
Una innovación reciente en las técnicas de
rastreo consiste en inyectar a las células diminutas
cantidades de peroxidasa de rábano picante (PRP), enzima
distribuida por toda la célula y cuya presencia puede
mostrarse por varias reacciones. Cuando se divide una
célula que tiene PRP inyectada, la enzima se distribuye en
las células hijas. Puesto que persiste en la progenie
celular, la PRP se ha tornado en una importante herramienta para
mapear linajes celulares. La peroxidasa de rábano picante
pueden inyectarse en una de las células del embrión
temprano, al cual se le permite desarrollarse por algún
tiempo parea después seccionarse.
Las células que descienden de una célula marcada
originalmente con PRP retienen la marca, en tanto que
estará ausente en las demás células del
embrión. Debido a que tiende a distribuirse por toda la
célula la PRP también se inyecta en células
neurales en desarrollo, donde se difunde a través de sus
procesos largos, permitiendo al investigador valorar la
dirección que toman los procesos y con qué otras
células se conectan.
Las células en que se ha marcado el DNA sustancialmente
con isótopos radiactivos se utilizan para la
localización en extremo precisa de células
emigrantes. Este tipo de marcación isotópica tiene
la desventaja de que cada división celular diluye a la
marca, lo cual hace una técnica adecuada para rastreos a
largo plazo de células que se dividen con rapidez.
Una categoría importante de marcación, en
especial para el rastreo de células a largo plazo, es la
de los marcadores "naturales". Al introducir células en un
embrión que difieren de las del huésped por su
tamaño, pigmentación, tipos isoenzimáticos,
complementos cromosómicos o número de
nucléolos, se produce un marcador estable. La cromatina
sexual se ha empleado con cierto éxito, aunque los
principales avances más recientes en cuanto a las
técnicas de rastreo implican la utilización de
células de codorniz japonesa como injertos marcadores en
embriones de pollos. Las diferencias en el tamaño nuclear
y la morfología, así como la facilidad para
injertar los segmentos de tejido de codorniz en los sitios
homólogos de los embriones de pollo, han permitido a los
investigadores solucionar una serie de antiguos problemas
relativos al origen celular y a la composición de ciertos
tejidos y órganos.
2.6 INMUNOLOGÍA
Las células de diferentes tipos, o aun las distintas
etapas de desarrollo de un mismo tipo de célula, contienen
diferentes proteínas y polisacáridos en el
citoplasma o en sus membranas de superficie. Estas
macromoléculas son antigénicas; es decir, cuando se
inyectan en otro animal, como el ratón o conejo, ocasionan
que sus células inmunes formen anticuerpos en contra de
ellas. Al prepararse los anticuerpos adecuadamente en contra de
antígenos específicos, pueden ser de gran
valor en los estudios de desarrollo en tanto es posible
emplearlos para descubrir en un tejido u órgano la
presencia o ausencia específica de la molécula
antigénica en cuestión. En la investigación
embriológica es común tomar una sección de
tejido que se sospecha contiene un antígeno, para cubrirlo
con un líquido que contiene un anticuerpo en contra de ese
antígeno. Si el antígeno está presente en el
tejido, el anticuerpo se combina con él. Este complejo
antígeno-anticuerpo no puede investigar
estáticamente, por lo que a continuación suele
añadirse un segundo anticuerpo dirigido al primero. Sin
embargo, el segundo forma un complejo con la molécula
marcadora, por lo general una que posee propiedades
fluorescentes, de modo que el marcador podrá descubrirse
con un microscopio de fluorescencia, y así su
localización en el tejido indicará la presencia del
antígeno en cuestión. Inmunocitoquímica es
el nombre que suele recibir el proceso de ubicación de
moléculas específicas en tejidos mediante
anticuerpos.
Existe una nueva y poderosa técnica inmunológica
que implica la producción de anticuerpos
monoclonales, diseñada para producir anticuerpos
excepcionalmente puros y específicos. Aunque Milstein ha
compendiado bien los detalles de esta técnica, en pocas
palabras consiste en inyectar primero un antígeno a un
ratón.
Después se extraen las células productoras de
anticuerpos del bazo del ratón y se fusionan con una
célula del tipo de tumor conocido como mieloma. Las
células fusionadas (que ahora se llaman hibridomas)
pueden conservarse en cultivo. Cuando un hibridoma produce un
anticuerpo de interés, se cultiva como un solo clono y se
permite su multiplicación. Así, todos sus
descendientes celulares producirán la misma variedad,
altamente específica, del anticuerpo monoclona, y mediante
una técnica de cultivo adecuada, podrán preservarse
casi indefinidamente como fábricas de ese anticuerpo
específico.
Las técnicas inmunocitoquímicas que se dirigen
tanto a las células como a los componentes de la matriz
extracelular han proporcionado valiosa información con
respecto a la localización de cantidades diminutas de
antígenos importantes en el desarrollo, así como
del momento de su aparición a medida que avanza el
desarrollo.
2.7 TéCNICAS
MICROQUIRÚRGICAS
Mucha de la información fundamental sobre los
mecanismos causales en el desarrollo embrionario, sobre todo los
que implican interacciones de tejidos, se ha obtenido a
través del uso de técnicas microquirúrgicas.
El trabajar con embriones que a menudo no miden más de
algunos milímetros ha requerido el desarrollo de
herramientas especiales, como las agujas de vidrio o tungsteno y
las asas de cabello de lactante, en vez de los bisturís y
fórceps que comúnmente se relacionan con la
cirugía usual. Para el trabajo con embriones en extremo
pequeños o con grupos de células se utilizan
micromanipuladores en lugar de manos para tomar los
instrumentos.
Las técnicas microquirúrgicas se utilizan en
muchos tipos de experimentos, y una de las más sencillas
es la ablación o extirpación de la parte de
un embrión para valorar el efecto que tendrá la
ausencia de esa estructura en el embrión restante. El
trasplante y explante son técnicas
quirúrgicas muy comunes y tienen amplias aplicaciones en
la investigación embriológica.
El explante consiste en extraer una pequeña muestra de
tejido embrionario y desarrollarlo en un medio artificial, si
bien esta técnica puede manejarse de diferentes formas.
Uno de los métodos estriba en injertar el tejido extirpado
en un organismo huésped al interior de un sitio
específico bien abastecido de nutrimentos, pero que
deberá crecer y diferenciarse sin influencia de los otros
tejidos de su propio cuerpo que normalmente lo rodean. Al
trabajar con embriones de aves es común explantar un grupo
pequeño de células de un individuo joven en la
membrana corioalantonica de un huésped de mayor
edad.
Entre los embriones de mamífero, los sitios favorables
son las cámaras anteriores del ojo la región
vascular del peritoneo. Los experimentos con explantes han
proporcionado mucha información acerca de la forma en que
el tejido se adapta y diferencia en un sitio nuevo. Por otra
parte, algunos primordios embrionarios exhiben una asombrosa
capacidad de autodiferenciación, indicando que hay
suficiente información al interior de los tejidos
trasplantados para dirigir el desarrollo del órgano.
En los estudios embriológicos los tejidos algunas veces
se trasplantas a otros del mismo embrión
(autoinjerto), aunque los tejidos u órganos de un
embrión donante con frecuencias se injertan en
huéspedes de especies diferentes (heteroinjerto) o
incluso de distinto orden (xenoinjerto). Algunos tipos de
experimentos con trasplantes implican cambios o rotaciones
menores en los tejidos, si bien en otros tipos, la estructura
embrionaria se desplaza en gran medida de su ubicación
normal. Se ha encontrado que los tejidos embrionarios
trasplantados y los tejidos del huésped no permanecen
pasivamente lado a lado, ya que antes bien ejercen profundas
influencias en el curso de desarrollo de sus nuevos vecinos. Como
se verá, los ejemplos de este tipo de influencia han sido
particularmente asombrosos en el campo de la inducción
embrionaria.
En una aplicación reciente de trasplantes, no se
implicaron tejidos u órganos sino componentes de
células individuales. Mediante la técnica de
trasplante nuclear desarrollada por Brigss y King (1952), Gurdon
(1962) trasplantó el núcleo del epitelio intestinal
de una rana (xenopus) posmetamórfica, a un huevo
cuyo núcleo se había inactivado con
radiación ultravioleta (UV), dando como resultado
el desarrollo de una rana adulta. Este experimento
demostró que hasta el núcleo de una célula
epitelial intestinal contiene suficiente dotación de
información genética para guiar el desarrollo de un
animal maduro completo desde el huevo.
Por lo menos en un caso se ha empleado la técnica de
trasplante con fines comerciales. Un grupo de criadores
sudafricanos de ganado lanar deseaba criar una cepa especial de
ovejas originarias de Escocia. El transporte de una cantidad
suficiente de borregos maduros a Sudáfrica requería
un largo y costoso viaje. El problema se resolvió
extrayendo óvulos recién fecundados de las ovejas
escocesas para trasplantar los embriones tempranos en
úteros de conejas, las cuales a a continuación se
enviaron por avión a Sudáfrica, donde se les
extrajeron los embriones de borrego y de nuevo se trasplantaron
en los úteros de las ovejas hembras locales. A su debido
tiempo, las ovejas sudafricanas parieron borregos normales de la
cepa escocesa, para así completar la transferencia a larga
distancia del rebaño de ovejas.
La aplicación clínica de la técnica de
transferencia embrionaria tuvo como consecuencia el
nacimiento del primer ser humano concebido al exterior del
útero en el caso de una mujer inglesa que no podía
embarazarse debido a un bloqueo en las Trompas de Falopio que
prevenía que los huevos ovulados llegaron al útero.
Dos biólogos de reproducción, Robert Edwards y
Patrick Steptoe, obtuvieron un óvulo de los ovarios de
esta mujer y lo fecundaron in vitro con el espermatozoide
del esposo. Se permitió que el embrión se
desarrollara hasta la etapa de ocho células y a
continuación lo trasplantaron al útero de la mujer.
El embrión se implantó en el revestimiento uterino,
dando como resultado un embarazo sin problemas y el nacimiento de
una niña normal.
2.8 TéCNICAS DE CULTIVO
Una de las formas más interesantes de estudiar el
desarrollo embrionario estriba en cultivar componentes de
embriones, y hasta embriones completos, en un medio artificial.
Según la naturaleza del material explantado, las
técnicas se conocen como cultivo de células,
tejidos, órganos e incluso de embriones completos. Cada
tipo de cultivo requiere métodos ligeramente distintos,
pero el principio es el mismo.
El material embrionario se coloca en platos o tubos de vidrio
o plástico y se rodea con un medio de cultivo artificial,
diseñado para semejarse en la mayor medida posible al
medio que circunda al material en su sitio normal embrionario. El
medio de cultivo ideal se define químicamente en su
totalidad; sin embargo, con frecuencia es necesario añadir
factores biológicos indefinidos como suero, y hasta
extractos de embriones completos, para proveer los factores de
crecimiento necesarios. Existe cada vez mayor conocimiento que la
naturaleza del sustrato que se coloca en las células, sea
el plástico del plato o el material adicional de matriz
extracelular, es una determinante considerable para el
éxito del cultivo.
El método de cultivo se desarrolló en un
experimento revolucionario realizado por Ross G. Harrison (1907)
en su interno por encontrar un método que
demostrará el crecimiento nervioso. A partir del tiempo
transcurrido desde sus investigaciones pioneras, los
métodos de cultivo han contribuido enormemente a nuestra
comprensión de los procesos de desarrollo. En la
actualidad, el cultivo de tejidos o de rudimentos de
órganos es con frecuencia sistemático, y en algunos
tipos de células como el corazón es posible
producir clonos diferenciados de células precursoras
individuales. En años recientes ha crecido el
interés por los cultivos de órganos complejos y de
embriones de mamíferos completos: si embargo, los avances
en el refinamiento de las técnicas de este tipo suelen ser
lentas, y el trabajo, por ende, frustrante.
Una ventaja importante de las técnicas de cultivo
radica en que el medio circundante o el tejido mismo puede
alterarse a menudo en ciertas formas que serían imposibles
in vivo. Una desventaja, sobre todo en los cultivos de
células y tejidos, es que en ocasiones es difícil
distinguir entre los procesos que sólo operan en
condiciones de cultivo y los que suceden naturalmente en el
embrión.
2.9 TéCNICAS BIOQUÍMICAS Y
MOLECULARES
El análisis bioquímico de los tejidos
embrionarios, en particular con el uso de las técnicas
más recientes de la biología molecular, constituye
una de las formas de más rápido crecimiento para
estudiar el desarrollo. Las técnicas bioquímicas
que se utilizan para investigar los sistemas embrionarios
incluyen casi todas las que hoy día se usan en la
bioquímica, motivo por el cual tan sólo se
mencionarán categorías generales en el espacio que
se asigna a esta sección. Entre los métodos
más antiguos están las técnicas puramente
químicas diseñadas para investigar la presencia o
ausencia de compuestos específicos y sus cantidades. El
tratado de Neddham (1931) resume mucho de este material. El
análisis de la actividad enzimática con frecuencia
se emplea en los estudios sobre las propiedades
metabólicas del embrión.
En estos experimentos se permite que se lleve a cabo una
reacción química que implique la mediación
de una enzima (como sucede en la mayor parte de las reacciones
biológicas) y a continuación a menudo se mide el
producto (por lo general por medios espectrofotométricos)
y se compara con una curva de referencia.
Los métodos de separación se utilizan
ampliamente en los estudios de embriones. Las primeras
técnicas de este tipo fueron la cromatografía del
papel y la electroforesis, las cuales hacen uso de las
propiedades físicas de compuestos, como los
aminoácidos o proteínas, que les proporcionan
diferentes propiedades migratorias en soluciones o campos
eléctricos Entre las moléculas que pueden separarse
mediante la electroforesis se encuentran las isoenzimas o
isozimas, que son formas diferentes de moléculas con la
misma actividad enzimática, pero con estructuras
ligeramente distintas que les permiten separarse entre sí.
Como las diferentes formas de la isozima de una enzima dada con
frecuencia se constituyen n por poblaciones individuales de tipos
de células en diversos momentos, suelen ser buenos
marcadores del desarrollo.
Otra familia de las técnicas de separación es la
que implica la centrifugación de soluciones u homogenados
de tejidos que contienen macromoléculas. Después de
centrifugarse prolongadamente a altas velocidades, las fracciones
subcelulares o diferentes clases de macromoléculas se
estratifican según su tamaño o densidad.
Los métodos de columnas cromatográficas se
desarrollaron para separar muchas clases de compuestos,
según sus diversas características físicas.
En las técnicas de columna típicas, se carga una
columna con cuentas u otros materiales diseñados para
permitir la migración diferencial de las moléculas
y se añade al tubo una solución que contenga una
familia de macromoléculas, por lo general, ácidos
nucleicos. Se permite que el líquido de la columna gotee
en la parte inferior hacia un colector de fracciones, un
recipiente de algún tipo lleno de tubos. Los tubos se
mueven en intervalos periódicos y su contenido de material
molecular refleja la velocidad del paso de las moléculas a
través de la columna. A continuación es posible
examinar el líquido para observar el contenido de las
moléculas en cuestión. Si se ha empleado
también marcación isotópica, como sucede por
lo regular, se analiza cada tubo para medir la radiactividad.
Se ha diseñado asimismo una serie de técnicas
altamente especializadas para demostrar especies particulares de
ácidos nucleicos contenedores de información. Estas
técnicas aprovechan la secuencia única de las bases
que constituyen la cadena del DNA o RNA e implican la
hibridación de una cadena sencilla de DNA con una
de DNA o RNA, de forma tal que hay un emparejamiento de conjuntos
complementarios de bases. Las técnicas de
hibridación han resultado ser muy valiosas para demostrar
la presencia o ausencia de secuencias específicas de bases
en los ácidos nucleicos de las células
embrionarias.
Algunos de los avances recientes más impresionantes en
nuestro conocimiento del desarrollo incluyen la aplicación
de nuevas tecnologías genéticas, entre las que se
incluyen la preparación del DNA recombinante, la
construcción de genes sintéticos y la capacidad de
preparar sondas moleculares específicas. La
tecnología de recombinación del DNA perite la
producción de grandes cantidades de una secuencia dad de
DNA, lo cual se logra mediante la ayuda de
plásmido, pequeñas moléculas
circulares de DNA que se reproducen de forma independiente en las
bacterias. Tanto el DNA de eucariote como el DNA del
plásmido se someten a un tratamiento simultáneo de
una familia de enzimas de restricción que segmentan las
cadenas del DNA en combinaciones específicas de pares de
bases. Ambos fragmentos que se desprenden del DNA del eucariote
se adhieren nuevamente al DNA del plásmido y reconstituyen
un nuevo círculo que incluye un segmento del DNA
eucariótico. Cuando se introducen estos plásmidos
recombinantes en bacterias como Escherichia coli, el DNA
plasmático se replica y el DNA eucariótico
también se transcribe. Dado que las bacterias poseen un
proceso casi ilimitado de multiplicación, la enzima
de DNA eucariótico puede producirse en grandes cantidades,
y la información genética en el DNA puede entonces
utilizarse para originar productos genéticos, como las
hormonas de proteína. Una de las primeras aplicaciones de
la tecnología de DNA recombinante fue la producción
de insulina humana.
Una variedad muy útil de sondas moleculares es la de la
molécula cDNA, que puede producirse al incubar una mezcla
de mRNA definido, nucleótidos y la enzima transcriptasa
inversa, que permite la síntesis de una sola cadena de
DNA, a partir del mRNA. Como se mencionó anteriormente,
las cDNA con marcación radiactiva pueden añadirse a
secciones de tejidos prueba (hibridación in situ)
para descubrir la presencia del mRNA correspondiente en el
tejido. Cuando está presente bel RNA, el cDNA marcado se
hibridiza con el mRNA, y el complejo se puede descubrir de manera
autorradiográfica.
2.10 TéCNICA DE
RADIACIÓN
Se han utilizado varias formas de radiación en
los estudios embriológicos, principalmente para causar
algún daño en partes del embrión. Para
realizar ciertos experimentos, se enfocan rayos X en
pequeñas regiones del embrión con objeto de obtener
un área circunscrita de lesión al tejido,
así como para inactivar un grupo de células. En
ocasiones se utilizan rayos ultravioleta para el mismo fin, pese
a que carezcan del poder de penetración profunda de los
rayos X. Los rayos láser han resultado ser una valiosa
herramienta para producir lesiones localizadas agudas en el
embrión. Es tal su precisión que pueden destruir
pequeñas regiones de cromosomas individuales.
2.11 USO DE MARCADORES
GENéTICOS
Son útiles en los estudios de desarrollo,
generalmente como rastreadores. De particular valor han sido las
cepas de ratones que han desarrollado diferencias
isoenzimáticas en la forma de ciertas enzimas. La
identificación mediante técnicas
electroforéticas de isoenzimas específicas ha
mostrado ser de utilidad como un método rastreador.
2.12 USO DE INHIBIDORES Y
TERATÓGENOS
En el proceso de análisis del desarrollo embrionario se
han utilizado muchos tipos de sustancias químicas para
inhibir los procesos embrionarios normales. En algunos casos, el
mecanismo de activación de un inhibidor químico
está bien definido, y una alteración en el
desarrollo puede atribuirse a alteraciones específicas en
la vía metabólica. Por ejemplo, se sabe que el
antibiótico actinomicina D inhibe la síntesis del
RNA, de modo que si se administra a aun embrión muy
temprano, el desarrollo procederá por lo general durante
un lapso breve, pero al poco tiempo se inhibirá
notoriamente. Puede inferirse por consiguiente que la etapa en
que se inhibió el desarrollo requería la
síntesis de moléculas nuevas de RNA.
En la mayor parte de los casos aún se desconoce el
mecanismo exacto de la activación perturbadora que
ocasiona una sustancia química o una radiación (de
rayos X o ultravioleta). Por ello, los efectos de estos agentes
sólo pueden interpretarse a un nivel menos
específico, en ocasiones implicando el efecto
intermediario de un tejido sobre otro en vez de un trastorno en
el proceso químico.
Se ha mostrado en años recientes que ciertos
medicamentos ocasionan muchos tipos de desarrollo anormal. Se
dice que dichos medicamentos tienen un efecto teratógeno y
se les conoce comúnmente como teratógenos. A
inicios de la década de 1960 se presentó un ejemplo
impresionante de la actuación de un teratógeno en
el desarrollo humano en Alemania Occidental y varios otros
países, donde un gran número de niños
nació con un tipo insólito de defecto en las
extremidades. En sus manifestaciones graves, faltaban los
segmentos proximales de los brazos y las piernas; las manos y
pies parecían crecer directamente del cuerpo. Dado que los
miembros se asemejaban a las aletas de una foca, ese trastorno se
categorizó como focomelia (apéndice de
foca). Pronto se descubrió que estas deformaciones eran
ocasionadas por un sedante supuestamente llamado
talidomida, de uso común entre las embarazadas de
estos países. El medicamento se ha retirado del mercado,
pero por sus ocasionales efectos trágicos, los
procedimientos de aprobación de cualquier medicamento
nuevo ahora incluyen rigurosos exámenes para saber si
ejercerán daños en los embriones.
Autora:
Lidia Benites Puelles
Universidad Nacional de Trujillo
Facultad de Ciencias Médicas
Escuela de Medicina Humana
Deparatamento de Morfología Humana – Área
embriología
Perú
2008
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