Diferenciación celular al linaje dopaminérgico (página 2)

La biología molecular ha
desarrollado una serie tecnologías que busca verificar las
funciones in
vivo de determinadas proteínas,
o los cambios en la expresión de distintos genes en
respuesta a situaciones experimentales que imitan el desarrollo
normal de los sistemas
vivos.

"Las células
troncales embrionarias son totipotentes y se encuentran en
pequeño número en el blastocisto donde pueden
expandirse en forma indiferenciada durante un corto tiempo y de
acuerdo al sitio donde se alojan, ellas adquirirán
determinados fenotipos de diferenciación. Las
células hemopoyéticas troncales se caracterizan por
poseer un gran potencial proliferativo, cuyo modelo de
regulación es jerárquico. Ellas retienen, a lo
largo de su existencia, un cierto grado de plasticidad, lo cual
hace que se puedan diferenciar en distintos tipos de
células o de tejidos no
hemopoyéticos, de acuerdo al microambiente donde se
encuentran o bien a la presencia de ciertos factores
estimulantes.

En trabajos recientes se han podido aislar, por adherencia al
plástico,
en cultivo in vitro de médula ósea,
células no hemopoyéticas que fueron llamadas
mesenquimales por su semejanza con el tejido mesenquimal del
embrión. Estas células, in vitro, pueden ser
inducidas hacia nuevas líneas celulares, que se
diferenciarán en nuevos tejidos. Las expectativas del
beneficio terapéutico del transplante de médula
ósea como el de células mesenquimales en enfermedades no
hemopoyéticas son grandes, porque al utilizar tejidos o
células autólogas, se evitan los graves problemas del
rechazo inmunológico. En el caso del tejido nervioso la
problemática de una fuente adecuada de donantes hace el
tema especialmente interesante".

PROTOCOLOS

La revista
Nature, en su número del 20 de junio de 2002,
publicó el trabajo de
un grupo de
investigadores del National Institute of Neurological
Disorders and Stroke, en Bethesda, Maryland, dirigido por Ron
MacKay en el que anuncian que han conseguido que células
madres embrionarias cultivadas, procedentes del cerebro medio de
ratones, se diferencien en neuronas productoras de dopamina y,
sobre todo, que proliferen en gran número.

Los investigadores, mediante sofisticadas técnicas
de ingeniería
genética, introdujeron el gen Nurr1 en las
células madres embrionarias, con el cual se pone en
marcha, con gran eficiencia, su
diferenciación en neuronas productoras de dopamina.

Estas neuronas, cuando son trasplantadas en el cerebro de
ratas con un modelo experimental de enfermedad de Parkinson
(precisamente dentro del área cerebral donde fueron
destruidas sus neuronas nativas productoras de dopamina)
funcionan normalmente y no sólo producen dopamina, sino
que establecen conexiones nerviosas (sinapsis) mediante la
extensión de sus axones y modifican la conducta
espontánea de dichas ratas.

Las ratas con el modelo experimental de enfermedad de
Parkinson, tras el trasplante de las neuronas generadas a partir
de células madres embrionarias, dejaron de moverse en
círculos /asimetría motora característica de
este modelo de Parkinson (y sobrevivieron entre 2 y 3 meses).

Ésta es una de las primeras demostraciones de que
neuronas productoras de dopamina, generadas a partir de
células madres embrionarias, pueden ser útiles en
la recuperación de animales con un
modelo experimental de enfermedad de Parkinson.

Uno de los problemas que ha de resolverse es que el nivel de
dopamina producido por las neuronas trasplantadas sea el
apropiado: desafortunadamente las neuronas trasplantadas producen
demasiada dopamina y algunas ratas trasplantadas que se
movían previamente en círculos contra-reloj, tras
el trasplante lo hacían en el sentido de las agujas del
reloj.

En definitiva, los autores concluyen que sus resultados apoyan
la idea de que neuronas derivadas de
células madres embrionarias sobreviven y funcionan
después de ser trasplantadas en el cuerpo estriado
cerebral que se ha sido lesionado.

Sus resultados justifican, para los autores, proseguir en las
investigaciones sobre la utilización
terapéutica de las células madres.

Fuente: http://www.saludlandia.com/celulas-madres-embrionarias-dopamina-parkinson-13502.html

A continuación se muestran algunos protocolos que
ejemplifican la diferenciación al linaje
dopaminérgico:

Especificación temprana del fenotipo
dopaminérgico durante la diferenciación de célula del
ES

Durante la formación embrionaria se toman las
decisiones del linaje (ES) la diferenciación de las
células es crítica
porque se da la producción controlada de célula
somáticas de tipo terapéutico. La generación
in vitro de neuronas dopaminérgicas, que constituyen el
tipo de células perdidas en pacientes que presentan la
enfermedad de Parkinson; los cerebros, requieren moléculas
inductivas por el FGF8, o una célula del estroma
desconocida derivada induciendo la actividad del (SDIA). Sin
embargo, la identidad
exacta de las células de respuesta a la
sincronización de la actividad inductiva que especifican
las neuronas dopaminérgicas en progenitores todavía
siguen siendo evasivas

Metodología

• Cultivo celular:

Las células de Sox1-GFP ES fueron mantenidas en el
medio modificado Glasgow de Eagles (GMEM) complementadas con el
mercaptoetanol 2, los aminoácidos no esenciales, el
bicarbonato de sodio, el suero fetal y el factor inhibitorio de
la leucemia (LIF) del becerro se mantuvieron en frascos al 10%
gelatinizados.

Las células del ES fueron cultivadas en una capa de las
células estromaticasl PA6 por 7 días en GMEM
complementadas con suero al 10% (Gibco) en una densidad de 60
células/cm2s.

En el día 7 el medio fue substituido por N2B27
(StemCellSciences) para el resto del período de la
diferenciación.

Las células del ES fueron tapados con plásticos
gelatinizados del tejido en N2B27 en una densidad de 10 000
células/cm2s. Ambos tipos de cultivos
diferenciación fueron procesados para FACS o en el
día 3-4 o 7.

• Clasificación de FACS:

Las células fueron tripsinizadas y suspendidas de nuevo
en el 1% BSA en un ambiente
salino con fosfato (PBS) y filtradas usando un tamiz para
asegurar la suspensión unicelular.

Las células vivas fueron bloqueadas basaron en la
dispersión frontal y la dispersión lateral y/o por
la exclusión del tinte 7AAD. En caso pertinente,
excluyeron a la mayoría de las células PA6 basado
en su aspecto diferenciado de el de los derivados de la célula
del ES en diagrama del
PE (autoflouresente) /FITC.

Las dos poblaciones de la célula fueron fijadas usando
las células PA6 y se distinguieron las células
parentales de E14TG2a ES. En algunos experimentos, las
células PA6 que fueron excluidas se basaron en su
inhabilidad de excluir 7-AAD. Recogieron a la población del progenitor de GFPpos y la
fracción distinguida GFPneg de la célula del ES y
la viabilidad de la célula al final del FACS que
clasificaba el procedimiento
usando el método de
la exclusión del tinte del azul trypan. Las células
clasificadas FACS fueron utilizadas para la diferenciación
neuronal y procesada directamente por el cytospin.

• Diferenciación neuronal

Las células clasificadas FACS fueron vueltas a lavar en
Polivinílico-D-lisina (PDL) /Laminin cubriendo los
plásticos y las células del PA6, en una densidad de
100 000 células/cm2s en ambos casos. Donde SHH indicado
(400 ng/ml, R& D), FGF8 (100 ng/ml, R& D), y FGF2 (10
ng/ml. R& D) fue agregada al medio N2B27. al final del
período del cultivo, las células fueron fijadas en
paraformaldehido al 4% (PFA) por 15 minutos a temperatura
ambiente seguida por 3 aclaraciones en PBS.

• Cytospin

Las células clasificadas FACS fueron diluidas a una
concentración de 1 × 105 cells/ml. el μl 100 de
las suspensiones de la célula de cada muestra fue hecho
girar en 1000 RPM por 4 minutos. Las células fueron
fijadas inmediatamente al 4% de PFA por 15 minutos a una
temperatura ambiente seguida por 3 aclaraciones en PBS.

• Inmunohistoquímica

Las células fijadas fueron suspendidas con el suero
normal al 0.2% por 1 hora seguida por la incubación
durante la noche con los anticuerpos primarios: anti-TH del
conejo (1: 1000, helada del PEL), anti-TH del ratón (1:
1000, chemicon o 1:500, PelFreeze), ratón
anti-β-III-TUBULIn (1: 500, Babco), conejo anti-Pitx3 (1:
500, regalo del Dr. M Smidt), ratón anti-En1 (1: 250,
DSHB), conejo anti-Nurr1 (1: 500, Santa Cruz), cabra anti-FoxA2
(1: 200, Santa Cruz), conejo anti-Lmx1a (1: 2000, alemán
de M), cabra el 4 de octubre anti- (1: 200, Santa Cruz), conejo
anti-Sox2 (1: 200, chemicon). Las células fueron lavadas 3
veces en PBS seguido por la incubación por 1-2 horas con
los anticuerpos secundarios flourescence-etiquetados (1: 200,
laboratorio de
Jackson) y DAPI (1: 1000).

• Cuantificación y análisis estadístico

El número de células positivamente marcadas fue
cuantificado contando 18 campos aleatoriamente seleccionados que
correspondía a más de 1000 neuronas en total.

DIFERENCIACIÓN NEURONAL EXTENSIVA DE
CÉLULAS MADRE NEURONALES DE HUMANO INSERTAS EN LA COLUMNA
VERTEBRAL DE RATAS ADULTAS

Derivación de Células
Madre Neuronales (NSCs) humanas.

Las NSCs humanas fueron preparadas de la médula
espinal torácica cervical y superior de un solo feto humano de
ocho semanas después de un aborto electivo.
El tejido fue donado por la madre de una forma completamente
unánime, teniendo en cuenta las pautas de los institutos
nacionales de la salud (NIH) y de la Agencia
de Medicamentos y Alimentos (FDA) y
aprobado por un comité examinador exterior independiente.
El tejido de la médula espinal fue despejado de meninges y
de ganglios de raíz dorsal y disociado en una
suspensión unicelular por trituración mecánica en medio sin suero, medio N2
modificado, compuesto de 100 mg/l de plasma humano
apo_transferrina, 25 mg/l de insulina humana recombinante, 1.56
g/l de glucosa, 20 nM
de progesteronas, 100 μM putrescina, y 30 nM de
selenito de sodio en DMEM/F12, al cual se le agregσ
el factor de crecimiento básico del fibroblasto
(bFGF) (10 ng/ml). El cultivo inicial fue ampliado en serie como
capas monomoleculares en frascos o placas cubiertos primero
según lo descrito [13]. Aproximadamente 6.1 ×
106 células fueron obtenidas sobre la
disociación inicial del tejido de la médula
espinal. Todas las células fueron puestas sobre una placa
de 150 milímetros en 20 ml de medio de crecimiento. El
medio de crecimiento fue cambiado cada día y, en
días alternos, se agregaron 10 ng/ml de bFGF.

El primer paso fue conducido en 16 días de
revestimiento posterior. En este punto de tiempo, el cultivo fue
compuesto principalmente de células NSCs divididas y
neuronas post mitóticas. Las células divididas
fueron cosechadas por el tratamiento transitorio con tripsina
(0.05% + 0.53 mM de EDTA) seguido de disociación mecánica. Así se derivó una
suspensión unicelular que fue centrifugada a 1.400 rpm por
cinco minutos. El pellet de la célula fue suspendido de
nuevo en medio de crecimiento, y las células se volvieron
a colocar en nuevas placas pre cubiertas a 1.2 x 106
células en 20 ml de medio por 150 milímetros de
placa. Las células fueron cosechadas a una confluencia de
aproximadamente 75%, que ocurrió en el plazo de cinco o
seis días.

Este proceso fue
repetido para 20 pasos. Las células de varios pasos fueron
congeladas en medio de crecimiento plus 10% DMSO y almacenadas en
nitrógeno líquido. Sobre el deshielo, el
índice total de recuperación fue del 80%-95%. La
línea celular resultante, producida solamente por medios
epigenéticos y usando el bFGF como el único
mitógeno, fue codificado "566RSC."

En este estudio fueron utilizadas las células de
los pasos 10-12. Fue deshelado un frasco criopreservado del paso
apropiado, lavado, y cultivado de nuevo como se describió
anteriormente, 5-7 d antes de la cirugía. Para
múltiples días de cirugías, los cultivos
fueron sembrados en diferentes densidades, de modo que cada
frasco alcanzara confluencia en el día de cirugía
señalado. Las células fueron cosechadas
posteriormente por el tratamiento transitorio enzimático
como se describe anteriormente, lavado en una solución
salina protegida, dirigido al sitio de la cirugía en hielo
mojado, y usado dentro de 24 horas. La viabilidad de las
células en hielo fue característicamente mayor del
80% dentro de éste periodo de 24 horas.

UN MODELO IN
VITRO DE NEURONAS DOPAMINÉRGICAS HUMANAS DERIVADAS DE
CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS: TOXICIDAD MPP (POSITIVAS) Y
NEUROPROTECCIÓN GDNF

Diferenciación
dopaminérgica:

Lineas de hESC (células madre embrionarias
humanas) BG01 y I6 pueden ser mantenidas en fibroblastos
embrionarios de ratón (MEF) alimentadas en
Dulbecco´s Modified Eagle"s Medium/Ham"s F12 (DMEM/F12,
1:1) suplementadas con 20% de knockout serum replacement (KSR),
2mM de amimnoácidos no esenciales, 2mM L-glutamine, 5
microgramos/ml Penn – strep (todas de Invitrogen; Carlsbad, CA),
0.1mM beta – mercaptoethanol (Specially Media; phillpsburg, NJ),
y 4ng/ml de factor de crecimiento de fibroblasto básico
(BFGF, sigma; St Louis, MO), ó en platos revestidos de
fibronectina en un medio condicionado con MEF por 24h.

Las células son pasadas manual o
enzimáticamente cada 5 días

El medio es cambiado cada día

La diferenciación dopaminérgica de hESCs
es inducida por la línea celular estromal PA6 del
ratón.

hESCs es sembrado a una densidad de 1000 grupos de
células aproximadamente por 3cm de plato sobre una capa
confluente de células alimentadoras PA6 en Glasgow Minimum
Essntial Media (GMEM, Invitrogen) suplementado con 10% Knockout
serum replacement (KSR, Invitrogen), 1mM de piruvato (Sigma),
0.1mM de aminoácidos no esenciales y 0.1mM beta –
mercaptoethanol.

Las hESCs permitieron la diferenciación a
neuronas dopaminérgicas por 3 semanas sobre células
prioritarias PA6 a tratamientos de droga.

El gen foxa2 controla el nacimiento y
la degeneración espontánea de las neuronas de la
dopamina en edad avanzada

Los modelos
dominantes para la enfermedad de Parkinson se basan en el uso de
toxinas químicas que matan las neuronas de la dopamina,
pero no tratan los factores de riesgo que
aumentan normalmente con edad. Los factores de la
trascripción son reguladores críticos de la
supervivencia y de la longevidad. El factor de la
trascripción del gen foxa2, se expresa
específicamente en neuronas adultas de la dopamina y sus
precursores en la placa intermedia.

Los experimentos del aumento y de la pérdida de
función
de este gen, foxa2, se requieren para generar las neuronas de la
dopamina durante el desarrollo fetal y de las células de
vástago embrionarias. Ratones que llevan solamente una
copia de las anormalidades del gen foxa2 en edad avanzada
presentan una pérdida progresiva de neuronas de la
dopamina. La función de manipulación del gen puede
regular el nacimiento de las neuronas de la dopamina y su
muerte
espontánea.

Materiales y
métodos

• Immunohistoqumica e histología:

Se toman ratones embarazados CD-1 y los
embriones se disecan y se fijan manualmente en paraformaldehido
al 4% (PFA) en PBS.

Son transferidos a sacarosa al 20% durante la noche, y
son embebidos en compuesto de O.C.T (tissue Tek,
Sakra).

Se cortan 12 secciones μm en un
criostαtico de 500 OM y se procesan para
estudios immunohistoquimicos.

Las secciones marcadas con el anticuerpo anti-SHH son
tratadas con 50 milímetros NH4Cl por 20 minutos a una
temperatura ambiente y lavadas dos veces con PBS antes de la
incubación con el anticuerpo primario.

Los ratones adultos son anestesiados con sodio de
pentobarbital (nembutal) y sumergidos en 20 ml de PBS seguido por
40 ml de el 4% PFA.

Los cerebros son disecados hacia fuera, y transferidos a
sacarosa al 20% durante la noche, se cortan 40 secciones
μm en un criostαtico y se mantienen
secciones flotantes en PBS. y se visualiza en un microscopio
focal.

Todo el trabajo fue
realizado de acuerdo con el instituto nacional de los protocolos
de los desordenes neurológicos y de los estudios animales
del movimiento
(NINDS) 1204-05, 1205-05, y 1247-05, según lo aprobado por
el comité del cuidado animal y del uso de NINDS. El conteo
de las células fueron realizadas en cada sexta
sección dentro del cerebro-medio, directamente en el
microscopio.

En los casos en los cuales la densidad de célula
hizo difícil discernir fácilmente las
células individuales, los cuerpos de célula
mancharon para el TH, RALDH1, y GFAP fueron emparejados a sus
núcleos DAPI-etiquetados.

Para estimar el número absoluto de neuronas de la
dopamina del cerebro medio, multiplicamos el número total
de células por seis (frecuencia de muestreo).

Medimos los núcleos de 50 neuronas de la dopamina
del cerebro-medio, en el SN y el VTA, y determinamos el
diámetro nuclear.

Para Nissl que marcaba, 40 secciones del cerebro del
fueron lavadas en agua destilada
y montadas en diapositivas.

Las secciones fueron tratadas con un reactivo violeta
por 5 mínimos y después lavadas otra vez en agua
destilada. Las diapositivas entonces fueron tratadas con una
serie del etanol (el 50%, el 70%, el 90%, el 95%, y 100%) y
finalmente sumergidas en xileno por 2 minutos.

• Anticuerpos:

Para estudios immunohistoquimicos las secciones del
embrión del ratón y de las células fijas in
vitro, se utilizan los siguientes anticuerpos:
β-galactosidasa (1: 500, conejo monoclonal;
Biogénesis); BrdU (1: 200, rata monoclonal; Axyll); FOXA2,
Islet1, LIM1/2, NKX2.2, PAX7, y SHH (1: 10, ratón
monoclonal; Banco de
desarrollo del hibridoma de los estudios, universidad de
Iowa); FOXA2 (1: 4.000, conejo policlonal; regalo de Ariel Ruiz I
Altaba); FOXA2 (1: 50, cabra policlonal; Biotecnología de Santa Cruz); GATA3 (1:
200, ratón monoclonal; Biotecnología de Santa
Cruz); GFAP (1: 500, conejo policlonal; DAKO); LMX1b (1: 4.000,
conejillo de Indias policlonal; regalo de T. Jessell); LMX1b (1:
500, conejo policlonal; regalo de la moleta del T.); nestin (1:
500, conejo policlonal; Laboratorio de McKay); NKX2.2 (1: 400,
conejillo de Indias policlonal; regalo de B. Sosa Pineda); NKX6.1
(1: 1.000, conejo policlonal; regalo del alemán del M.);
PTX3 (1: 400, conejo policlonal; Upstate); RALDH1 (1: 100, conejo
policlonal; regalo de Greg Duester); Phox2a (1: 800, conejo
policlonal; regalo del Brunet de J. – F.); SOX1 y SOX2 (1: 500,
conejo policlonal. regalo de la Lovell-Divisa del R.); e
hidroxilasa de la tirosina (1: polyclonals de 500, del conejo y
de las ovejas; PEL-freez).

• Cultivo celular:

Los embriones E8.5 (9-13 somaticos) fueron obtenidos de
los ratones embarazados sincronizados CD-1.

Los embriones fueron incubados en el medio del N2 que
contenía la amilasa del 1% (sigma) durante 1 h a 37°C,
para facilitar la disección manual.

Después de retiro del tejido mesenquimatico
ectodermo, los cerebros medios embrionarios fueron movidos al
medio amilasa-libre del N2. El tejido reunido era lavado 3 veces
en PBS y después digerido en el medio del N2 que
contenía 0.005% Tripsina-EDTAS (Gibco) para el minuto 5 en
la temperatura ambiente.

Las células mesencefalicas disociadas fueron
agregadas al medio inhibidor de la tripsina del N2 que
contenía (sigma), a 100 ng/ml FGF2, a 100 ng/ml (FGF8), y
a 500 ng/ml Shh (R& Sistemas de D).

El medio fue cambiado al medio del N2 (sin el inhibidor
de la tripsina) que contenía 100 ng/ml FGF8 y
shh.

Las células fueron fijadas con el 4% PFA
después de 4h de extensión. Para probar la
proliferación de célula, las células fueron
tratadas con 10 el μM BrdU (Roche) 1 h antes de
la fijaciσn.

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Colombia, Ibagué, 11 de junio de 2008

Autor:

Henao Muñoz Liliana Marcela*

Leiva Sandoval Ana Maria*

Mayorga Beltrán Erika Lucia*

Mosquera Cicero Yudy Alexandra*

* Facultad de Ciencias.
Programa de
Biología. Universidad del Tolima. Ibagué (Tolima).
Colombia.