Fijación biológica del nitrógeno (página 2)

El género
Azotobacter es uno de los microorganismos utilizados como
biofertilizantes que más se aplica e
investiga en países en vías de desarrollo.
Sus propiedades beneficiosas se ponen de manifiesto en una gran
variedad de hortalizas, granos y viandas (Mayea et al., 1998).
FAO (1995) reporta que este se considera de menor importancia
agrícola por incorporar modestas cantidades de
nitrógeno al suelo,
Bhattacharya y Chaudhuri (1993) reportan que es capaz de fijar de
20 a 30 kg. de N ha-1 año, pero tanto
Azotobacter como Azospirillum en determinadas condiciones su
efecto beneficioso no se debe solamente a la cantidad de
N2 atmosférico fijado, sino a la capacidad de
producir vitaminas y
sustancias estimuladoras del crecimiento (ácido
indolacético, ácido giberélico, citoquininas
y vitaminas) que influyen directamente en el desarrollo
vegetal.

Otro grupo de
microorganismos que se convierten en fijadores de N2
cuando viven en asociaciones simbióticas con organismos
superiores de vida son las bacterias
pertenecientes al género Rhizobium, las cuales establecen
relaciones simbióticas con plantas
leguminosas.

Entre los diferentes sistemas
biológicos capaces de fijar N2
atmosférico, la simbiosis Rhizobium-leguminosa constituye
con la mayor cantidad aportada al ecosistema y a
la producción de alimentos
(Burdman et al., 1998). Aunque hay diversas asociaciones que
contribuyen a la fijación biológica del
N2, en la mayoría de lugares agrícolas
la fuente primaria (80%) del nitrógeno fijado
biológicamente ocurre a través de dicha simbiosis
(Anónimo, 2001 b). Se estima que esta puede oscilar entre
200 y 250 kg. N ha-1 año (FAO, 1995),
calculándose que puede alcanzar el 20 % de la cantidad
fijada anualmente sobre el planeta, constituyendo la
asociación más elaborada y eficiente entre plantas
y microorganismos (Burdman et al.,1998).

Dentro de las especies que establecen relaciones
simbióticas con esta bacteria se encuentra el frijol
común (Phaseolus vulgaris L.), la cual es la legumbre
más importante para el consumo humano
en los países del tercer mundo, pero a su vez es la
especie de más baja capacidad de nodulación y
fijación de N2. Este cultivo en Cuba ha sido
durante muchos años una práctica común del
campesinado, cuya producción cumplimentó en
determinado grado las necesidades del país. Actualmente la
producción es insuficiente, aproximadamente 0.63 t
ha-1, como resultado del nivel de vida de la población y su poca intensificación.
Durante varios años la producción de este grano ha
estado
limitada a las pequeñas producciones del agricultor
privado, por lo que el Estado ha
tenido que invertir $ 400 (USD) para adquirir una tonelada de
frijol mediante la importación de este alimento para el
consumo de la población. Resulta obvio que aumentar el uso
y mejorar el manejo del N2 fijado
biológicamente por esta leguminosa es una meta importante
para la agricultura
tanto por razones humanitarias como por razones económicas
(FAO, 1995; Burdman et al., 2000; Quintero, 2000).

En los últimos 20 años se han realizado
ingentes esfuerzos por parte de científicos e
investigadores en todo el mundo con el fin de llevar a cabo una
mayor eficiencia en la
fijación de N2 por parte de la simbiosis
Rhizobium-leguminosa en el cultivo del frijol, basados en las
herramientas y
perspectivas moleculares de las secuencias génicas y la
trangénesis de plantas, alternativas que atentan contra la
biodiversidad,
sin tener en cuenta los estudios sobre la bioquímica
de las asociaciones microbianas, los que han abierto un nuevo
horizonte que está cambiando la percepción
de la diversidad microbiológica.

Los efectos agronómicos de los experimentos de
microorganismos asociados a la rizosfera de las plantas
conjuntamente con los simbióticos han promovido un
sistema de
estudios para la mayor comprensión de las comunicaciones
entre plantas y microorganismos Estos constituyen una fuente
básica para la utilización de la fijación
biológica del N2 con el fin de mejorar la
productividad
de los cultivos incluyendo los microorganismos fijadores de
nitrógeno asociados a la rizosfera, como Azotobacter y
Azospirillum; y aquellos que viven en estrechas relaciones
simbióticas con las plantas, tales como: Rhizobium sp.,
Azolla sp. y endo / ectomicorrizas (Fisher y Long 1992, citado en
Anónimo, 2001 a).

• ORGANISMOS
  FIJADORES

FIJACIÓN SIMBIÓTICA DE
NITRÓGENO

I.- Dos grupos de
organismos:

1.- Rizobios

Bacterias del suelo móviles atraídas hacia
la raíz por compuestos que ésta libera.

Pertenecen al grupo de quimioorganotrofos
aerobios

A este grupo pertenecen Rhizobium,
Azorhizobium y Bradyrhizobium

Formadores de nódulos en raíces

Rhizobium: Nodulan leguminosas de climas
templados y subtropicales

Cuatro especies:

R. leguminosarum var. viciae, var.
trifolii, var. phaseoli

R. meliloti que nodula Melilotus y
Mendicago

R. Loti que nodula Lotus, Cicer, Lupinus,
Mimosa, etc.

R. fredii nodula soja

Bradyrhizobium nodula soja.

Formadores de nódulos en tallos y
raíces

Azorhizobium: Nodula la planta tropical
Sesbania rostrata (leguminosa)

Otros formadores de nódulos de fijación de
nitrógeno dudosa

Phyllobacterium: Forma nódulos en tallos y
hojas de mirsináceas y rubiáceas.

Agrobacterium: Se han descrito casos en los que
parece haber fijación de nitrógeno.

2.- Frankia: Actinomicetos que nodulan
raíces de muchos árboles
y arbustos (más de 140 especies). No forma micelio
aéreo y sus esporas son inmóviles

Nodula los géneros alnus, Myrca,
Casuarina, etc.

Esta nodulación es muy importancia para plantas
leñosas perennes porque aporta nitrógeno al suelo
en zonas pobres o repobladas.

 II.- Interacción de rizobios con la
planta

1.- Especificidad del hospedador

2.- Etapas de la nodulación

Quimiotactismo: Cada tipo de planta exuda un tipo de
compuestos fenólicos quimioatrayete diferente.

• Alfalfa luteolina
• guisante apigenina y eriodictiol
• trébol blanco dihidroxiflavona

También liberan quimiorepelentes del mismo tipo
(flavonoides, etc.).

La sensibilidad bacteriana puede detectar
concentraciones de 50 nM

La interacción se establece mediante las lectinas
(glicoproteínas) de la pared celular de las plantas y las
bacterias.

Deformación del pelo radicular

Sólo una parte (aprox. el 255) de los pelos
radiculares contactados se deforma.

La inducción de la deformación es
específica

Invasión

En un primer momento parece ser debida a la alta
concentración bacteriana en el entorno del pelo radicular
deformado.

La bacteria parece ser la responsable de la
hidrólisis de la pared celular de la planta.

La formación de los tubos de infección
sólo se produce si hay una interacción
bacteria-planta (no hay plantas que formen tubos sin que haya
bacterias presentes).

Formación del primordio

Proceso complejo de diferenciación celular en la
planta como respuesta a la infección.

Los tipos de nódulos son diferentes en plantas de
climas templados y en tropicales:

Templados: Guisante, trébol, alfalfa

Nódulos indeterminados: tienen un meristemo
apical persistente

Tropicales: Soja, judía

Nódulos determinados: sin meristemo apical
persistente

Diferenciación dentro del primordio

3.- Interacción de Frankia con la
planta

El micelio de Frankia alcanza un pelo radicular
de la planta y lo invade. Se suele inducir luego la
formación de una raíz secundaria que también
resulta invadida.

La simbiosis no es obligada para que se produzca
fijación de nitrógeno. La simbiosis se establece
principalmente con el género alnus (aliso). Esta
simbiosis es mucho menos específica que la de
rhizobium

FIJACIÓN DE NITRÓGENO EN
ASOCIACIONES

Se ha detectado de forma indirecta fijación de
nitrógeno en asociaciones de plantas como la caña
de azúcar,
maíz,
sorgo y trigo, entre otras, y bacterias comno Azotobacter,
Azospirillum, Beijerinckia, bacillus y Pseudomonas
que colonizan las zonas radiculares por la alta relación
C/N de estas zonas.

Tabla 1. Microorganismos fijadores de
nitrógeno (tomado de CASTILLO & CÁRDENAS
(1990) (modificado por los autores).

1. FIJACIÓN BIOLÓGICA DEL
   NITRÓGENO

   La fijación biológica del
   nitrógeno atmosférico, consistente en la
   reducción de N2 a
   NH4+ por la enzima nitrogenasa, es,
   después de la fotosíntesis, la ruta metabólica
   más importante para el mantenimiento de la vida en la Biosfera.
   Curiosamente, este proceso
   crucial sólo puede ser llevado a cabo por unos pocos
   grupos de seres vivos, todos ellos procariotas (Sprent J. y
   Sprent P., 1990).

   Los microorganismos fijadores de nitrógeno no
   constituyen un grupo taxonómico homogéneo, la
   única característica que comparten es la
   presencia de la enzima nitrogenasa (Zehr J.P. y col., 1998).
   Dichas bacterias comprenden organismos fototrofos, como
   bacterias pertenecientes a la
   familia  Rhodospirillaceae, Clorobiaceae y
   Cianobacteriae; organismos quimioautotrofos, como bacterias
   de los géneros Thiobacillus, Xanthobacter y
   Desulfovibrio y organismos heterotrofos como las
   bacterias petenecientes a la familia
   Frankiaceae, al grupo Rhizobiaceae y a los géneros
   Azotobacter, Enterobacter, Klebsiella y
   Clostridium (Sprent J. y Sprent P., 1990).

   Estos organismos pueden realizar la fijación
   biológica de nitrógeno ya sea
   independientemente (a excepción de las
   rizobiáceas) o estableciendo relaciones
   simbióticas con otros organismos. Son estas formas
   simbióticas, concretamente las establecidas entre las
   rizobiáceas y las leguminosas, las que antiguamente
   eran aprovechadas para la renovación de los suelos
   mediante la práctica de la rotación de
   cultivos; hoy en día sin embargo, desde la
   aparición de la "revolución verde" en agricultura, esta
   práctica se ha sustituido por la utilización de
   fertilizantes químicos a pesar del elevado coste
   energético y ambiental que supone. Para poder
   disminuir la dependencia a fertilizantes nitrogenados que
   está adquiriendo la agricultura mundial se han
   propuesto varias alternativas que abarcan desde la
   modificación genética de las plantas a la
   optimización y mejora de la fijación
   biológica de nitrógeno (Vance C.P.,
   2001).

    Dentro de esta última opción el
   sistema rizobiáceas-leguminosas es el que ha sido
   estudiado ampliamente y en mayor profundidad. Ya en el siglo
   XVI Leonhard Fuchsius dibujó leguminosas noduladas
   (Fuchsius L., 1542) y en el siglo XVII, Malpighi
   observó nódulos en raíces de
   judía (Phaseolus vulgaris) y de haba (Vicia
   faba) (Malpighi M., 1675). No fue sin embargo hasta
   finales del siglo XIX cuando el botánico ruso Woronin
   detectó la presencia de bacterias en nódulos de
   lupino y alisos (Woronin M.S., 1866). Unos años
   después Frank demostró que en suelos quemados
   no se producían nódulos (Frank B., 1879) y a
   continuación Hellriegel y Wilfarth, que son los
   investigadores reconocidos universalmente como descubridores
   de la fijación simbiótica, demostraron en
   varias leguminosas el requerimiento de una infección
   previa para la formación del nódulo (Hellriegel
   H. y Wilfarth H., 1888). Posteriormente Beijerinck
   corroboró la necesidad de una infección
   bacteriana para la formación del nódulo al
   infectar plantas de Vicia faba con cultivos puros
   procedentes de nódulos de dicha leguminosa (Beijerinck
   M.W., 1888). No obstante, no ha sido hasta en estos
   últimos 20 años cuando se ha empezado a
   comprender este sistema íntimamente si bien aún
   hay algunos puntos del proceso simbiótico que se
   desconocen.

    Una de las incógnitas es la influencia
   de algunos nutrientes especialmente requeridos por el sistema
   en el establecimiento y desarrollo de la simbiosis,
   así como en la organogénesis del nódulo.
   Concretamente se ha observado que la deficiencia de un
   micronutriente, el boro (B), afecta drásticamente a la
   nodulación llegando al punto de abortarla
   (Bolaños L. y col., 1994), aunque no se ha probado la
   causa última de tan drástico efecto.
   También se ha sugerido la existencia de una
   relación entre este micronutriente y un macronutriente
   como el calcio (Ca2+). En este sentido se ha
   observado que la relación B-Ca2+ es
   importante para el mantenimiento estructural de la pared
   celular (Kobayashi M. y col., 1999), y que juega un papel en
   el proceso de simbiosis en leguminosas (Carpena R.O. y col.,
   2000). Nuestras investigaciones van encaminadas precisamente a
   profundizar en el conocimiento de las consecuencias de la
   deficiencia del B en distintos pasos de la nodulación
   y analizar el papel que juega el Ca2+ durante
   dicha deficiencia, así como la relación
   existente entre ambos bioelementos a lo largo de todo el
   proceso de simbiosis. Un segundo objetivo
   de nuestra investigación en este campo es el
   estudio del papel de dicha relación B/Ca en
   condiciones de estrés salino, donde hemos encontrado
   cómo los suplementos de B y Ca recuperan la
   fijación simbiótica del nitrógeno,
   así como el desarrollo y la productividad de plantas
   noduladas de guisante, muy inhibidas en condiciones
   salinas.

    Fijación
   biológica de nitrógeno en
   leguminosas

   Las rizobiaceas son un grupo muy heterogéneo
   de bacterias que se han dividido en cuatro familias:
   Rhizobiaceae, Phyllobacteriaceae, Hyphomicrobiaceae y
   Bradyrhizobiaceae (Madigan M.T. y col. 2000). Dentro de estas
   familias sólo unos determinados géneros son
   capaces de efectuar el proceso de fijación de
   nitrógeno: Rhizobium, Sinorhizobium,
   Meshorizobium, Bradyrhizobium,
   Azorhizobium y Allorhizobium. Con el fin de
   simplificar la lectura
   nos referiremos a todos estos géneros como
   Rhizobium.

    A diferencia de las cianobacterias y las
   bacterias pertenecientes al género Frankia, las
   rizobiáceas no pueden generar un ambiente
   anaerobio o microaerobio en donde poder realizar la
   fijación de nitrógeno por si mismas. Para
   llevar a cabo el proceso estas bacterias han de encontrarse
   en las inmediaciones de plantas de la familia de las
   fabáceas e interactuar con las mismas, originando una
   serie de reacciones en la planta que desencadenarán la
   formación de un órgano mixto nuevo, el
   nódulo simbiótico, en el cual se proporciona un
   entorno controlado, así como los nutrientes necesarios
   para que la bacteria pueda efectuar el proceso de
   fijación.

    Antes de llegar a la consecución del
   nódulo, tanto la planta como la bacteria han de seguir
   un protocolo,
   de tal manera que, si cualquiera de ellos incumple alguna de
   las condiciones establecidas, la formación del
   nódulo abortará. Dicho protocolo se puede
   resumir en:

   1)    Intercambio de señales de naturaleza
   química entre la planta y el microorganismo.

   2)   Activación del ciclo
   celular en células del córtex e
   iniciación del nuevo órgano en la
   planta.

   3)   Infección por parte de la
   bacteria, formación del canal de infección e
   invasión de los tejidos
   recién formados.

   4)   Diferenciación de la
   bacteria a forma especializada.

2. MECANISMO DE
   ORIENTACIÓN: BACTERIAS – LEGUMINOSAS

   Iniciación del
   nódulo

   
   Señalización entre la planta y
   Rhizobium

   Se puede definir como rizosfera a la porción
   de suelo íntimamente asociada a las raíces de
   plantas en crecimiento con propiedades físicas,
   químicas y biológicas diferentes a las del
   resto del suelo y con una estructura
   extraordinariamente compleja en la que inciden gran
   número de variables
   y en la que se establecen multitud de relaciones
   biológicas. De hecho, las características
   físico-químicas de dicha región hacen de
   ella un lugar muy adecuado para el crecimiento de
   microorganismos (Bazin M.J. y col., 1990), de los cuales los
   más abundantes son las bacterias, en gran parte
   propiciado por la presencia de los exudados de la planta
   ricos, entre otros, en compuestos carbonados. Entre el 10% y
   el 30% de los fotosintatos de la planta son secretados en los
   exudados radiculares (Bowen G.D. y Rovira A.D., 1999)
   abarcando carbohidratos, ácidos
   orgánicos, vitaminas, aminoácidos y derivados
   fenólicos. Entre dichos compuestos se encuentran los
   flavonoides (derivados del 2-fenil-1,4-benzopirona) (Fig. 1)
   cuya composición va a variar dependiendo de la
   especie, y que además de ser metabolizados,
   desencadenan una serie de respuestas específicas en
   los rizobios circundantes apropiados. Así, algunos de
   estos flavonoides a concentraciones nanomolar, provocan la
   quimiotaxis activa de los rizobios hacia la superficie
   radical (Sánchez F. y col., 1991). En cambio,
   estos mismos flavonoides a concentración micromolar,
   activan en Rhizobium a los genes responsables de la
   nodulación (genes nod).

   

   Cada Rhizobium expresa constitutivamente un
   grupo de factores de transcripción
   hélice-lazo-hélice de la familia LysR (Schell
   M.A., 1993) conocidos como NodD cuyo número y
   regulación va a depender de la especie de
   Rhizobium, así por ejemplo en Sinorhizobium
   meliloti hay tres copias de NodD, siendo dos de ellas,
   NodD1 y NodD2, activadas por flavonoides mientras que NodD3
   es activada por SyrM (Symbiotic Regulator),
   homólogo de NodD que además de regular NodD3
   induce la síntesis de exopolisacárido
   (EPS) independientemente de la presencia de flavonoides
   (Swanson J.A. y col., 1993). NodD se encuentra normalmente
   unida a unas regiones de ADN de 49 pb
   conocidas como "nod boxes", que se encuentran en las
   regiones promotoras de muchos genes implicados en la
   nodulación, sólo se produce la inducción
   de estos genes cuando NodD se une a sus activadores (Schultze
   M. y Kondorosi A., 1998). Entre los genes activados por NodD
   se encuentran los genes nod, que codifican todo un
   paquete de enzimas
   encargadas de la producción de los factores Nod. Los
   factores  Nod  están compuestos por un
   esqueleto de N-acetil-D-glucosamina unidos por enlaces
   -1,4 sintetizado por NodA, NodB y NodC, que presenta
   una serie de modificaciones dependiendo de la estirpe de
   Rhizobium y que van a otorgar de cierta especificidad
   al proceso de nodulación (Spaink H.P.,
   2000):

   

   

   1)      Variación en
   el número de monómeros de
   N-acetil-D-glucosamina, oscilando generalmente entre 3 y 6
   unidades.

   2)      La presencia o la
   ausencia de modificaciones en la molécula indicadas
   como Rn en la figura 2, entre las que podemos destacar la
   aparición o no de un grupo sulfato en el extremo
   reductor.

   3)      Distintos
   ácidos grasos pueden ir unidos a la molécula
   dependiendo de la estirpe rizobiácea. Esta
   característica hace que a los factores Nod se les
   conozca también como lipooligoquitinas o, más
   comúnmente, lipoquitooligosacáridos (LCO en
   inglés).

   4)      La presencia o
   ausencia de ácidos grasos insaturados ,
    especiales.

   Señalización entre Rhizobium
   y la planta

   La mera presencia de los factores Nod en
   concentraciones del orden 10-12 M es suficiente
   para que en la planta se produzca la deformación de
   los pelos radiculares (Lerouge P. y col., 1990; Heidstra R. y
   col., 1994) pero se necesitan niveles mayores, del orden
   de 10-7 a 10-9 M para provocar la
   formación de los pre-canales de infección, la
   división de las células corticales y la
   inducción de genes implicados en las fases previas a
   la nodulación, las nodulinas tempranas  (Truchet
   G. y col., 1991). Esta elevada sensibilidad a los factores
   Nod hace suponer que debe existir un mecanismo mediado por
   receptores aunque aún no se han podido ni determinar
   el número ni identificarlos, no obstante se han
   propuesto hipótesis:

   1)      Modelo de
   un único receptor (Hirsch A.M., 1992): se propone la
   existencia de un único receptor cuya actividad va a
   venir dada por la estructura del factor Nod, el cual se
   integraría en la membrana celular de la planta a
   través del grupo acilo.

   2)      Modelo de dos
   receptores (Ardourel M. y col., 1994): con esta
   hipótesis se
   plantea la posible presencia de dos receptores, ambos
   necesarios para iniciar el proceso de nodulación. Uno
   de los receptores no posee una especificidad muy elevada en
   el reconocimiento de los factores Nod pero puede inducir la
   deformación del pelo radicular, la formación
   del primordio del canal de infección y la
   división de las células corticales aún
   en ausencia de la bacteria. El segundo receptor es más
   específico e induce la formación del canal de
   infección y del nódulo aunque siempre es
   necesaria la presencia de la bacteria. Este modelo
   actualmente es el que va cobrando más fuerza.
   Así se ha descubierto un posible receptor de factores
   Nod, que presenta una elevada homología a receptores
   tirosina quinasa (Endre G. y col., 2002), y que además
   presenta dominios de unión a otras proteínas. Una de estas
   proteínas podía ser una proteína G de
   membrana la cual también es necesaria para la
   percepción de los factores Nod (Pingret J.L. y col.,
   1998).

   Uno de los primeros efectos que se observa tras la
   percepción del factor Nod en el pelo radicular es la
   entrada de Ca2+ al citoplasma (Felle H.H. y col.,
   1998; Cárdenas L. y col., 1999). Ello conduce a la
   activación de ciertos canales aniónicos que
   originan la expulsión de Cl- y por tanto la
   despolarización de la membrana del pelo. No se conocen
   los mecanismos que inducen la entrada de Ca2+,
   aunque se ha propuesto que podría estar mediado por
   proteínas G (Pingret J.L. y col., 1998) y mantenido
   por canales de Ca2+ sensibles a voltaje. Esta
   entrada de Ca2+, además de servir como
   mensajero para la inducción de genes y
   activación de proteínas implicadas en la
   nodulación, induce una reorganización del
   citoesqueleto, que contribuye a la deformación del
   pelo radicular hasta llegar a una forma característica
   del fenómeno de la nodulación, el "cayado del
   pastor" (Shepherd’s crook en inglés).
   Esta estructura generará una pequeña cavidad en
   donde la bacteria puede crecer y prosperar.

   

   Invasión y
   formación del canal de
   infección

   La unión de las bacterias a la superficie de
   la raíz es un paso preliminar muy importante que
   precede a la invasión. Fibrillas de celulosa
   producida por la bacteria pueden ayudar a enredar al rizobio
   en la superficie mucilaginosa de la raíz, proceso
   reforzado por la presencia de proteínas dependientes
   de Ca2+, ricadhesinas, producidas por la bacteria
   (Smit G. y col., 1989). Es por ello que los
   polisacáridos y proteínas producidos por
   Rhizobium pueden jugar un papel importante en la
   interacción física entre la
   planta y la bacteria. Así, mutantes que carecen de EPS
   ni invaden ni forman canales de infección.

   Aunque aún no se conoce el papel
   específico del eps en los prolegómenos de la
   relación entre la planta y la bacteria, sí se
   ha hipotetizado sobre dichas funciones
   (Gray J.X. y Rolfe B.G., 1990). Entre otras, el eps
   podría enmascarar la superficie bacteriana para evitar
   el desencadenamiento de una respuesta de defensa por parte de
   la planta, encapsular a la bacteria contra el estrés
   fisiológico que existe en el canal de
   infección, identificar a la bacteria ante el receptor
   de la planta adecuado…

   Otro factor a considerar es el hecho de que esta
   matriz
   extracelular puede formar una estructura gelatinosa en
   presencia de iones de calcio (Morris V. y col., 1989). Dicha
   capacidad podría servir para retirar los iones de
   Ca2+ presentes en el entorno de la pared vegetal,
   que normalmente son utilizados para estabilizar y organizar a
   las pectinas recién sintetizadas y, por tanto,
   debilita esa zona de la pared habilitando así un lugar
   propicio para la infección. Además, la
   presencia de un gel de naturaleza tan rígida puede
   servir a la bacteria como punto de apoyo para entrar en el
   pelo aprovechando la presión que ejercen las sucesivas
   divisiones de la bacteria. De este modo se origina una
   invaginación de la membrana del pelo por la cual las
   bacterias infectan a la planta (Fig. 3).

   

   Paralelamente y coincidiendo con la entrada de la bacteria en
   el pelo radicular, en el interior del mismo se produce un
   trasiego de vesículas que volcarán su contenido
   en el entorno de la bacteria (Brewin N.J., 1991) formando
   así los primordios del canal de infección,
   estructura a través de la cual las bacterias van a
   discurrir por la planta hasta llegar al nódulo. Las
   estructuras preinfectivas se inducen por
   acción de LCOs en leguminosas con
   nódulos indeterminados (van Brussel A.A.N. y col.,
   1992), y en algunas con nódulos determinados como
   Lotus, aunque no en Phaseolus (van Spronsen
   P.C. y col., 2001; Niwa S. y col., 2001). Más tarde se
   detallan estos dos tipos de desarrollo del nódulo. La
   formación del dicho "camino" de infección
   está dirigida por la planta merced a la
   deformación del citoesqueleto que induce una
   invaginación en la vacuola generando los llamados
   puentes citoplasmáticos (van Brussel A.A.N. y col.,
   1992) cuya orientación comunica unas células
   con otras y por los cuales irá creciendo la bacteria.
   A lo largo de toda la luz del canal
   existe una matriz glucoproteica cuyos componentes proceden
   tanto de la planta como de la bacteria (Broughton W.J. y
   col., 2000). Así, por parte de Rhizobium nos
   encontramos, entre otros, glúcidos cíclicos,
   lipopolisacárido (LPS), fundamental para una correcta
   infección, succinoglucano y EPS, siendo éste
   último crucial para la iniciación y posterior
   elongación del canal de infección (Cheng H.P. y
   Walker G.C., 1998). La planta por su parte, entre los
   distintos compuestos que liberan las vesículas al
   canal de infección, aporta arabinogalactanos (o
   PsENOD5 en guisante) y proteínas ricas en prolina como
   ENOD12, pero el componente principal es material
   glucoproteico denominado glucoproteína de matriz (MGP)
   (VandenBosch K.A. y col., 1989), recientemente identificado
   como un tipo de extensina (Wisniewski J.P. y col., 2000), que
   es secretada por las células del pelo radicular y del
   córtex y que se acumula tanto en el canal de
   infección como en los espacios intercelulares de
   células  no infectadas (Rae A.L. y col., 1991).
   Es una glucoproteína constitutiva cuya
   expresión en el proceso de infección se ve
   incrementada y cuya presencia es necesaria para el desarrollo
   del canal de infección (Rae A.L. y col., 1992). Se la
   ha relacionado con un mecanismo de defensa de la planta, al
   observar cómo plantas infectadas con bacterias
   mutantes en la síntesis de lipopolisacárido
   (LPS), aumentan su secreción (Perotto S. y col.,
   1994).

   Desarrollo del
   nódulo

   Dependiendo del sistema simbiótico podemos
   encontrar dos tipos de nódulos: determinados o
   indeterminados. Ello va a venir dado por el lugar en donde se
   induzcan las divisiones mitóticas en la raíz.
   Así, si se originan en el córtex interno se
   originan nódulos indeterminados y si lo hacen en el
   córtex externo nódulos determinados. Ambos
   tipos de nódulos, además de presentar una
   estructura anatómica distinta, también difieren
   en la forma en que se comporta la bacteria dentro del
   nódulo en formación. A pesar de ello, la
   inducción del ciclo celular en ambos sistemas sigue la
   misma regulación.

   El ciclo celular en
   las plantas

   Las células eucariotas discurren por su ciclo
   vital pasando por una serie de fases que tienen como función la de preparar y controlar el
   estado de la
   célula, con el fin de conseguir una
   división y, sobre todo, de asegurar una
   transmisión fiable de la dotación génica
   del organismo:

   1)      Fase G1:
   periodo en el que las células llevan a cabo
   principalmente las tareas de supervivencia cotidiana. Es en
   esta fase del ciclo cuando las células pueden
   diferenciarse, entrando entonces en quiescencia o en la fase
   G0.

   2)      Fase S: espacio
   temporal durante el que se produce la replicación de
   la dotación génica.

   3)      Fase G2:
   periodo previo a la mitosis y
   citocinesis en el que la célula además de prepararse para
   la división pasa por una serie de controles para
   verificar la fiabilidad de la replicación
   cromosómica.

   4)      Fase M: breve etapa
   del ciclo celular en la que se produce el reparto de la
   dotación cromosómica y la división
   celular. En determinadas ocasiones una célula puede
   saltarse esta fase originando un aumento en la ploidía
   celular, encontrándonos entonces un fenómeno de
   endorreduplicación.

   Debido a la rigidez de la pared celular el movimiento
   no juega un papel importante en el desarrollo de la planta,
   en contraste con los tejidos animales. Por
   ello, la morfogénesis en las plantas depende de la
   división celular y expansión celular, apoyados
   por la capacidad totipotente que presentan las células
   vegetales para cambiar su destino en respuesta a
   señales externas (Burssens S. y col., 1998). A
   diferencia de los animales, en los que la
   organogénesis ocurre originalmente en el
   embrión, el crecimiento usual de plantas implica tanto
   organogénesis embriónica como
   post-embriónica. El tallo primario y los meristemos
   apicales de la raíz se forman inicialmente como parte
   del embrión en desarrollo y generan las células
   que se dividirán para formar el tallo y la
   raíz. Pero a lo largo de la vida de las plantas se
   generan estructuras nuevas como por ejemplo las raíces
   laterales a partir de células del periciclo, o la
   formación de nódulos a partir de células
   del córtex en leguminosas o de células del
   periciclo en actinorrizas. Por regla general, para la
   formación de nuevas estructuras se requieren la
   inducción de nuevos meristemos, lo que implica que
   células ya diferenciadas, normalmente en la fase
   quiescente o G0, vuelvan a reentrar en el ciclo
   celular, fenómeno que salvo en contadas ocasiones no
   se produce en animales.

   Generalmente, la regulación del ciclo celular
   depende de la presencia de dos familias de proteínas,
   las ciclinas (Cyc) y las quinasas dependientes de ciclinas o
   CDKs. Proteínas de ambas familias van a aparecer o
   desaparecer dependiendo de la fase del ciclo en el que se
   encuentre la célula y regulando la transición a
   la fase siguiente.

   Las ciclinas controlan la actividad de las CDKs
   así como sus substratos y su localización
   subcelular. Las CycA y CycB se expresan de forma dependiente
   a la fase del ciclo celular, aunque las CycA empiezan a
   expresarse en la fase S, tanto ella como CycB presentan un
   pico de expresión en la transición
   G2-M (Mészáros T. y col., 2000). La
   expresión de las CycD sin embargo no depende del ciclo
   celular, se expresan en presencia de mitógenos,
   concretamente, estas ciclinas se inducen en momentos precisos
   durante la reentrada en el ciclo celular y se mantienen
   inducidas en células en división (Meijer M. y
   Murray J.A.H., 2000). Las ciclinas se regulan mediante su
   inducción y por procesos
   proteolíticos, así CycA y CycB presentan unos
   dominios denominados "destruction box" que regulan su
   proteolisis mediante un proceso dependiente de ubiquitina;
   sin embargo la mayoría de las CycD presentan
   secuencias PEST (pro, glu, ser, thr) que es una señal
   para su rápida degradación (Huntley R.P. y
   Murray J.A.H., 1999).

   Las CDKs son serin-treonin quinasas
   específicas cuya actividad es regulada tanto por la
   asociación con ciclinas como con fenómenos de
   fosforilación y desfosforilación (Joubès
   J. y col., 2000). Existen dos grupos, el primero de ellos,
   PSTAIRE, son CDKs que poseen esta secuencia
   aminoacídica dentro de un entorno de 16 residuos en un
   motivo de interacción con ciclinas. Es una familia de
   CDKs que guardan una gran homología con la CDK
   cdc2 de Schizosaccharomyces pombe y de
   ahí reciben su nombre.  El segundo grupo, los
   CDKs sin PSTAIRE, tienen un motivo distinto en una
   posición equivalente, PPTALRE o PPTTLRE, y reciben el
   nombre de clase
   CDK-b. Además en base a análisis de expresión
   génica y de homología de secuencias se ha
   sugerido que existen dos subgrupos (CDK-b1 y CDK-b2). Dichos
   grupos se encuentran presentes en la transición de la
   fase S a fase M a pesar de que en otros eucariotas las CDKs
   PSTAIRE son las únicas responsables de la
   regulación G2-M. La actividad de las CDKs
   no sólo requiere la unión a la ciclina sino
   además la fosforilación en un residuo de
   treonina en el T-loop por una quinasa activadora de CDKs
   (CAK). Además las CDKs pueden ser inhibidas mediante
   la fosforilación en Thr14 y Tyr15 por las quinasas
   myt1 y wee1. Dichos fosfatos han de ser
   eliminados por parte de la familia de fosfatasas cdc25
   para reactivar a la CDK. Por otro lado en cultivos celulares
   de tabaco se
   ha demostrado que en ausencia de citoquinina se bloquea el
   ciclo celular en G2 (Riou-Khamichi C. y col.,
   1999) y sólo se reanuda cuando existe otra fuente de
   cdc25 añadida por medios de
   genética molecular. Esto demuestra que las
   citoquininas participan en la desfosforilación de
   CDKs, aunque en Arabidopsis se ha observado que
   también regulan la transición G1-S
   al activar CycD3.

   Uno de los puntos claves de regulación para
   la entrada en el ciclo celular es la transición de la
   fase G1 a la fase S. Implica la
   participación de proteínas similares al
   retinoblastoma (Rb), los factores de transcripción E2F
   y las ciclinas D y sus CDKs correspondientes. Una de estas
   proteínas, Rb, es muy importante para la
   regulación del ciclo celular ya que además de
   unir el factor de transcripción E2F, impidiendo que
   ejerza su función,  puede inducir la presencia de
   histonas desacetilasas en los promotores de los genes
   regulados por E2F provocando la inactivación de los
   mismos. Esta desactivación del sistema E2F mantiene a
   la célula en fase G1. No obstante, la
   recepción de señales externas como las debidas
   a la presencia de auxinas, citoquininas y sacarosa inducen la
   activación del complejo CycD y su CDK que van a
   fosforilar sucesivamente a Rb. Esta hiperfosforilación
   de Rb, además de provocar su inactivación
   induce la liberación de E2F el cual activa la
   transcripción de ciertos genes cuyo producto
   conduce a la transición a la fase S. Entre dichos
   genes se encuentran las CycA y CycB que junto con las CDK
   PSTAIRE van a actuar regulando sobre todo la
   transición de G2 a M al fosforilar, entre
   otras moléculas, a las histonas provocando la
   condensación de la cromatina (Mészáros
   T. y col., 2000).

   

   

   Como se ha mencionado anteriormente, en algunas
   ocasiones el ciclo puede saltarse la fase de mitosis (M),
   bien porque las células se diferencian en fase
   G2 en lugar de en fase G1 o bien debido
   a la acción de ciertas proteínas, como Ccs52
   (Cell Cycle Switch) perteneciente a la
   familia de las proteínas WD-40, que se encarga de
   dirigir la degradación de los factores
   mitógenos (Cebolla A. y col., 1999).

   

    

   Desarrollo del nódulo
   indeterminado

   Los nódulos indeterminados se dan en plantas
   como las del género Medicago, Pisum,
   Trifolium y Vicia. En este tipo de
   nódulos son las células del córtex
   interior las que se reintroducen en el ciclo celular,
   además, tienen la característica de poseer un
   meristemo permanente, lo que les otorga una forma
   cilíndrica con simetría radial en la
   organización de los tejidos. Así en la zona
   más exterior se hallan las células vacuoladas
   del córtex, y hacia el interior se encuentran la
   endodermis y el parénquima, en donde también
   aparecen los haces vasculares. Todo ello cubre una zona
   central en donde Rhizobium se alberga y realiza la
   fijación de nitrógeno, y que será
   descrita con más detalle posteriormente.

   Se ha comprobado que en plantas crecidas en
   deficiencia de nitrógeno, a las pocas horas de la
   inoculación se induce la actividad mitótica en
   las células del córtex interior, debido a la
   actividad de los factores Nod (Calvert H.E. y col., 1984;
   Dudley M.E. y col., 1987) (Fig. 5A). Las primeras
   divisiones se producen en el plano anticlinal originando el
   primordio del nódulo. Desde el inicio se establece una
   polaridad en el primordio; así se mantiene la
   actividad meristemática en el ápice, causando
   un crecimiento del primordio hacia el exterior, mientras que
   las capas celulares inferiores se van diferenciando (Foucher
   F. y Kondorosi E., 2000) (Fig. 5B).

    Curiosamente el canal de infección
   nunca atraviesa células en división sino que
   progresa a través de los puentes
   citoplasmáticos de células que han quedado
   bloqueadas en la fase G2 (Foucher F. y Kondorosi
   E., 2000). Los canales de infección culminan en gotas
   de infección, de un tamaño que oscila entre los
   10 y 25 m de diámetro, en células
   diferenciadas de la región subyacente al meristemo
   nodular, en las que el ciclo celular está bloqueado.
   Dichas células, por un proceso de endocitosis, van
   captando las células de Rhizobium del canal de
   infección, las cuales alcanzan el ambiente
   endofítico rodeadas por membrana de origen vegetal que
   recibe el nombre de membrana peribacteroidea (mpb), dando
   lugar a un nuevo orgánulo denominado simbiosoma
   (Brewin N.J., 1991). Normalmente, estas células
   infectadas poseen una dotación cromosómica de
   8C, al haber entrado previamente en ciclos de
   endorreduplicación, en los cuales, como se ha
   mencionado anteriormente, Ccs52 juega un papel activo y
   fundamental. Se ha propuesto la existencia de una
   relación directa entre el tamaño del
   núcleo o la ploidía del mismo y el volumen final
   de la célula (Kondorosi E. y col., 2000). De este modo
   un aumento de la ploidía en la célula
   incrementa el espacio disponible para albergar el gran
   número de bacterias que la invaden.

   Este proceso de invasión y
   diferenciación define unas regiones dentro del
   nódulo indeterminado (Hirsch A.M., 1992) (Fig.
   6):

    1)      Zona I o
   meristemática: en el ápice del nódulo,
   corresponde a la zona de células en
   proliferación.

   2)      Zona II o de
   invasión: inmediatamente por debajo de la zona
   meristemática, es la región en la que se
   produce la invasión bacteriana a través de los
   canales de infección. Las células de esta
   región son más grandes y vacuoladas que las
   meristemáticas. Los rizobios en esta zona aún
   poseen una forma cilíndrica y pueden dividirse. Para
   diferenciarlos se los denomina bacteroides tipo 1.

   3)      Zona de
   prefijación: en esta región las células
   vegetales, que aún no han finalizado su
   diferenciación, están repletas de bacteroides
   de tipo 2 más alargados que los de tipo 1.

   4)      Interzona II y III:
   en esta franja, las células vegetales finalizan su
   proceso de diferenciación. Las células de esta
   región presentan numerosos amiloplastos así
   como tránscritos de leghemoglobina, proteína
   encargada de regular la presencia del oxígeno en el nódulo.
   Además nos encontramos bacteroides de tipo 3 los
   cuales presentan su tamaño final definitivo,
   así como una heterogeneidad citoplasmática
   característica.

   5)      Zona III o de
   fijación: región totalmente diferenciada en la
   que se realiza la fijación de nitrógeno
   propiamente dicha. Se subdivide en dos regiones: la zona de
   fijación y la zona ineficiente. En la primera, las
   gotas de infección han culminado su proceso de
   diferenciación, resultando en la formación del
   simbiosoma, compuesto por la membrana vegetal original
   modificada en su composición y un bacteroide de tipo 4
   con una estructura normalmente en forma de "Y" o de "T" y con
   una heterogeneidad citoplasmática notable, indicativa
   de su maduración en forma fijadora de
   nitrógeno. Por otro lado, las células vegetales
   no presentan tantos amiloplastos, porque posiblemente hayan
   sido consumidos durante la actividad fijadora de
   N2. La zona ineficiente está compuesta por
   células con bacteroides de tipo 5 que presentan un
   citoplasma homogéneo indicatorio del inicio de la
   senescencia.

   6)      Zona IV o de
   senescencia: región en la base del nódulo,
   comprendida por celulas vegetales y bacterianas en
   degradación y que se incrementa con la edad del
   mismo.

   No todas las células procedentes de la zona
   meristemática son infectadas, sino que se especializan
   en distintos tipos celulares (Brewin N.J., 1991). Algunas,
   por ejemplo, en la endodermis del nódulo forman una
   monocapa de células con una pared altamente suberizada
   que impermeabiliza a los gases el
   parénquima central del nódulo. Además,
   en dicha región existen células pequeñas
   que aparecen intercaladas entre las células
   infectadas. Estas células establecen una red que conecta el
   tejido central del nódulo con los haces vasculares, a
   través de la cual se transportan los sustratos
   carbonados a las células infectadas y se distribuyen
   al resto de la planta los compuestos nitrogenados generados
   en el nódulo (Scheres B. y col.,
   1990).  

   Desarrollo del nódulo
   determinado

   Este tipo de nódulos es inducido en plantas
   como las del género Phaseolus, Glycine,
   Vigna y Lotus, entre otras. A diferencia que en
   los indeterminados, en esta clase de nódulos no hay un
   meristemo permanente.

   

   

   Así, su crecimiento se basa en la
   expansión en vez de en la división celular,
   razón por la que presentan una morfología esférica en vez de
   cilíndrica (Hirsch A.M., 1992). La causa de la
   ausencia de un meristemo permanente la podemos encontrar en
   el proceso de formación. Se ha comprobado que las
   primeras divisiones celulares en respuesta a la presencia de
   Rhizobium son anticlinales y se producen en la
   hipodermis (Newcomb W. y col., 1979; Rolfe B.G. y Gresshoff
   P.M., 1988). A continuación, se genera otro foco de
   división celular en el periciclo. Posteriormente,
   estos dos meristemos convergen generando el primordio
   nodular, en el cual podemos encontrarnos células no
   vacuoladas procedente de las divisiones de la hipodermis
   conformando el tejido central del nódulo, y
   células con un elevado grado de vacuolización
   procedentes de las divisiones en el periciclo, componiendo el
   parénquima nodular que rodea al tejido central. gran
   parte de la actividad mitótica en la región
   central del nódulo se pierde transcurridos 12 a 18
   días tras la inoculación (Newcomb W. y col.,
   1979). Algunas células de este tejido central son
   invadidas a través de los canales de infección
   y pueden ser identificadas por su gran tamaño y
   densidad,
   debidos a la elevada presencia de simbiosomas en su interior.
   Estos simbiosomas, a diferencia de los existentes en
   nódulos indeterminados, pueden presentar más de
   un bacteroide en su interior. El resto de células, no
   infectadas, presentan un tamaño inferior y con una
   elevada vacuolización; además, en soja se ha
   comprobado que expresan la enzima uricasa encargada de la
   producción de ureidos que es la forma en la que se
   distribuyen los compuestos nitrogenados en estas plantas. Por
   otro lado, en el parénquima se encuentran varias capas
   de células separadas por exiguos espacios
   intercelulares y con un elevado contenido de proteínas
   ricas en prolina en su pared, que pueden contribuir a limitar
   la difusión del oxígeno al tejido central
   (Tjepkema J.D. y Yocum C.S., 1974). Sin embargo, el
   parénquima no tiene únicamente esta
   función protectora, ya que posiblemente puede
   participar en la producción de ureidos, al haberse
   detectado en la zona de contacto con el tejido central
   células que presentan un elevado número de
   peroxisomas, así como un gran retículo
   endoplasmático y la enzima uricasa (Newcomb E.H. y
   col., 1989).

   Diferenciación
   del simbiosoma

   De forma paralela al desarrollo del nódulo,
   Rhizobium se distribuye por el mismo a través
   de los canales de infección, o a través de la
   división de células previamente infectadas,
   según se trate de un nódulo indeterminado o
   determinado, a la par que va sufriendo una serie de
   modificaciones que culminan en la formación del
   simbiosoma, el cual presenta una serie de
   características que son indispensables para realizar
   la actividad fijadora de nitrógeno.

   En un simbiosoma se pueden distinguir los siguientes
   componentes:

   1)      Membrana
   peribacteroidea (mpb)

   2)      Fluido
   peribacteroideo (fpb)

   3)     
   Bacteroide

   Membrana
   peribacteroidea

   Esta envuelta es absolutamente necesaria para la
   actividad del simbiosoma (Regensburger B. y col., 1986), al
   servir de intermediario de señales y nutrientes entre
   la bacteria y la planta. Aunque tiene su origen en la
   porción de la membrana plasmática vegetal que
   rodea a Rhizobium durante la invasión, la
   naturaleza de la mpb madura se asemeja más a la de la
   membrana del tonoplasto. La razón de este cambio en la
   composición radica en la fusión de vesículas procedentes
   tanto del aparato de Golgi como del retículo
   endoplasmático que conduce al crecimiento de la
   membrana peribacteroidea. Por otro lado, esas
   vesículas transportan determinados componentes
   proteicos, como una H+-ATPasa, que pasan a
   incorporarse a esta cubierta. La actividad de esta
   proteína genera una acumulación de
   H+ en el espacio peribacteroideo, y por tanto un
   descenso de pH que el
   bacteroide va a combatir excretando el nitrógeno
   fijado en forma de amoniaco que en ese ambiente se
   encontrará ionizado como NH4+
   (Fig. 7). Los iones amonio pasan a través de un
   transportador específico de la mpb al citoplasma de la
   célula
   vegetal en donde el sistema GS-GOGAT los incorpora en
   forma de aminoácidos, amidas o ureidos. Además
   de un gradiente de pH, se genera un gradiente
   electroquímico aprovechado por determinados
   transportadores, como por ejemplo el de malato, con el fin de
   proporcionar sustratos carbonados al bacteroide.

   Se ha podido determinar que en el simbiosoma se
   acumula Ca2+ (Vincent J.M. y Humphrey B.A., 1963)
   y que además participa en la regulación de
   protein-quinasas de membrana que controlan el transporte
   de malato y amonio a través de la mpb.

   Fluido
   peribacteroideo

   El fluido peribacteroideo (fpb), definido como el
   material soluble existente entre la mpb y el bacteroide,
   mantiene en contacto la superficie de ambos, estableciendo
   una zona que permite la interacción. Como se ha
   mencionado anteriormente, es donde se va a acumular una alta
   concentración de H+ debido a la actividad
   ATPasa de la mpb (Fig. 7). Además, desde el aparato de
   Golgi se secretan proteínas al fpb
   características de lisosomas como proteasas,
   trehalasas ácidas o manosidasas, que hacen del
   simbiosoma un orgánulo con propiedades líticas
   (Mellor R.B., 1989). El equilibrio
   en el intercambio de metabolitos entre la planta y el
   microorganismo resulta vital para la simbiosis, de tal forma
   que, una alteración del mismo producida por alguno de
   los dos miembros de la asociación, llevaría a
   una acidificación en el interior del simbiosoma que
   conduciría a la activación de las hidrolasas y
   por lo tanto a la muerte
   del simbiosoma y a la senescencia del
   nódulo.

3. FORMACIÓN DE
   NÓDULOS