Obtención de vacunas contra Mycoplasma gallisepticum (página 2)

2. Para este fin, puede utilizarse una cepa de
   referencia de M. gallisepticum (ATCC) u otra
   específicamente caracterizada, identificada y
   tipificada. Dicha cepa, debe ser capaz de multiplicarse en
   medios
   artificiales mostrando las características de
   crecimiento propias de M. gallisepticum reportadas
   en el Bergey´s Manual
   of Sistematic Bacteriology, 1984 como por ejemplo:
   crecimiento masivo en placa en forma de "cielo estrellado",
   reportado como típico de esta especie cuando es
   subcultivada a partir de altas concentraciones celulares,
   ya que se establecen fuertes relaciones de competencia por el medio y como consecuencia
   poco crecimiento y desarrollo de las colonias (Figura 1). Al
   realizar diluciones de este cultivo, puede apreciarse la
   conocida forma de "huevo frito" (Figura 2), reportada por
   Razin (1983) como característica distintiva para el
   género micoplasma y consistente en
   una zona central granular opaca embebida en el agar y una
   zona traslúcida periférica. Por otra parte,
   la cepa de M. gallisepticum debe presentar las
   propiedades bioquímicas descritas para su especie,
   siendo positiva ante las pruebas
   de sensibilidad a la digitonina, fermentación de la glucosa,
   reducción del tetrazolium, capacidad de
   hemoaglutinar y producción de hemólisis, y
   comportarse de forma negativa ante la hidrólisis de
   la arginina, actividad fosfatasa y producción de
   film y spot, así como, debe estimular
   convenientemente el sistema
   inmune del animal a fin de lograr una respuesta
   protectora.

    

   Figura 1. Crecimiento de la cepa S6 de M. gallisepticum en placas de agar, en forma típica de "cielo estrellado" (35 x)

   Figura 2. Crecimiento de la cepa S6 de M. gallisepticum en placas de agar, en forma típica de "huevo frito" (35 x)

    

3. Selección y caracterización de la
   cepa

   El Banco de
   Células Primario o Banco Maestro es
   la fuente de semillas para la inoculación de todos
   los cultivos pues éste sirve para preparar el Banco
   de Células de Trabajo
   (BCT) y el Banco de Células de Producción
   (BCP); por lo que de la calidad
   del Banco Primario, con un número limitado de pases
   del microorganismo y conservado adecuadamente
   depende en primer lugar el mantenimiento de la uniformidad y la
   consistencia de la producción (de igual forma los
   BCT y BCP deben tener establecido y especificado el nivel
   de pases que presentan). Los controles de calidad de los
   bancos deben contemplar tres aspectos importantes: chequeo
   de la autenticidad de la cepa, pureza microbiana y
   viabilidad de los lotes fundamentalmente. (Manual OIE,
   1996; 9 CFR, 2001; Chiong, Sánchez, Rosado &
   Pérez, 2003).

4. Calidad de los Bancos de
   células
5. Medios de cultivo empleados

En el mercado
internacional pueden adquirirse medios comerciales para el
crecimiento de micoplasmas, como el medio PPLO (Difco) que
suplementado con extracto de levadura, suero equino y glucosa se
recomienda por el Manual OIE (1996) para la obtención de
antígenos y vacunas de
M. gallisepticum o el medio Mycoplasma base (Oxoid)
también suplementado con estos componentes.

Recientemente se desarrolló un nuevo medio de
cultivo (Varela et al., 2004) comercializado por BioCen, Cuba que es
utilizado satisfactoriamente en el crecimiento de M.
gallisepticum y otras especies de micoplasmas (Lobo, 2002;
Pérez, 2004)

1.1.5 Parámetros del proceso

Entre los parámetros del proceso de
fermentación de M. gallisepticum, se reporta el
empleo de
temperatura de
incubación para el crecimiento de 37 °C (Evans &
Hafez, 1992; Elfaki, Kleven, Lin & Ragland, 1993; Storm,
1995; Manual OIE, 1996), durante 24-30 horas aproximadamente en
cultivo batch, con pH del medio
de cultivo de 7,8 (Manual OIE, 1996).

Los micoplasmas se cultivan generalmente en frascos
incubados estáticamente debido a que son microorganismos
que demandan bajas concentraciones de oxígeno
disuelto para su crecimiento y que al no presentar pared celular
los efectos cortantes generados por la agitación pueden
dañarlos, pero esto no asegura la homogeneidad del cultivo
y los rendimientos obtenidos son muy pobres. Sin embargo, para la
obtención de vacunas, se reportan resultados
satisfactorios de crecimiento celular al cultivar cepas de M.
gallisepticum en zaranda (Miles, 1992; Pérez,
Sánchez, Rosado & Díaz, 1998) y en
fermentadores de diferentes escalas (Sánchez, Pérez
& Rosado, 1999; Sánchez, Pérez, & Rosado,
2002), logrando rendimientos celulares de hasta 5.1010
UFC/mL y velocidades de crecimiento de 0,25
h-1.

Otro aspecto importante es la relación volumen de
inóculo/volumen de medio de cultivo; comúnmente se
utilizan relaciones que van desde 1-10 %, reportándose por
varios autores (Windsor, 1992; Elfaki et al., 1993) el empleo del
10 % de volumen de inóculo con respecto al volumen
total.

1. Para la inactivación de micoplasmas se han
   utilizado métodos como la desintegración
   ultrasónica, tratamiento térmico, radiaciones
   y diferentes agentes químicos. Dentro de los agentes
   químicos inactivantes más empleados en
   cultivos de M. gallisepticum se encuentran: el
   formaldehido (Elfaki et al., 1993; Manual OIE, 1996; Vacuna
   MYPRAVAC. Laboratorios HIPRA, 1999), la beta-propiolactona
   (Yoder et al., 1983; Vacuna BIO MYCO. Catálogo del
   producto, Laboratorios Bioteke; Manual OIE,
   1996), timerosal (Barile, 1985; Pérez,
   Sánchez, Rosado & Martínez, 2006), etanol
   (Barile, 1985), entre otros.

   Dadas las características de los
   micoplasmas debe seleccionarse un agente químico
   inactivante del microorganismo que provoque el menor efecto
   posible sobre las proteínas de membrana; en tal sentido
   Windsor (1992) recomienda no emplear en lo posible el
   formol ya que este puede provocar daños en la
   estructura de la proteínas de la
   superficie de las células y como resultado afectar
   las propiedades antigénicas y con esto la eficacia
   de la vacuna. Por otra parte, cuando se emplean los
   inactivantes como el formol y la beta-propiolactona es
   necesario neutralizarlos con otro agente químico
   después de realizado el tratamiento (Schrier,
   1998).

   Para evaluar la efectividad del método de inactivación
   empleado, en la literatura
   se describen varias formas de realizar la
   comprobación (World Health Organization [WHO], 1973;
   British Pharmacopoeia, 1998), los cuales consisten en
   sembrar muestras del cultivo inactivado en medios de
   cultivo adecuados para el crecimiento de micoplasmas,
   incubar a 37 °C y chequear durante un número
   determinado de días que no se observe crecimiento de
   M. gallisepticum.

2. Inactivación microbiana

   Para la recuperación de la biomasa de M.
   gallisepticum se puede emplear la
   centrifugación, ultrafiltración u otro
   método de separación conveniente (Manual OIE,
   1996), aunque generalmente se utiliza la
   centrifugación. Las centrífugas de flujo
   continuo más usadas en estos bioprocesos son las de
   rotor tubular y las de discos (Aroca &
   Zúñiga, 2000; Pérez &
   Sánchez, 2004).

   La masa celular obtenida de la
   centrifugación es utilizada para la
   formulación del producto vacunal, aunque en algunos
   procesos
   de obtención de bacterinas se describe que a
   continuación de esta etapa se realicen varios pasos
   de lavado del sólido con buffer fosfato
   salino (PBS), pH=7,1-7,2, y nuevamente se separe la masa
   celular a través de centrifugaciones.

3. Recuperación aséptica de la
   biomasa

   En esta etapa, las células concentradas son
   diluidas en un volumen determinado de PBS, que permita
   obtener el nivel apropiado de contenido de antígeno
   final en la vacuna. La solución de PBS puede
   contener además algún preservante para evitar
   la contaminación; se reportan para este
   fin antibacterianos como penicilinas (Manual OIE, 1996),
   timerosal (0,01%) (Barile, 1985; Elfaki et al.,
   1993).

4. Ajuste de la concentración microbiana al
   valor
   deseado
5. Formulación

Las bacterinas oleosas han sido muy utilizadas como
método de control de la
micoplasmosis aviar, aunque hay que señalar que se han
evaluado bacterinas que para dispersar la fase acuosa, en lugar
de aceites, emplean por ejemplo, un polisacárido sulfatado
de origen natural (iota carrageenan) (Elfaki et al., 1993)
y complejos inmunoestimulantes (Sundquist et al.,
1996).

Generalmente las emulsiones del tipo agua en
aceite (w/o)
son capaces de inducir una respuesta inmune más potente
que las del tipo aceite en agua (Aucouturier, Dupuis, &
Ganne, 2001). Hasta el presente la mayoría de las vacunas
aviares inactivadas son basadas en emulsiones agua en aceite
(Schrier, 1998); específicamente para la
formulación de bacterinas de M. gallisepticum
diferentes adyuvantes se han empleado, reportando el Manual de la
SEPPIC (1992) y Sánchez et al. (2004) el empleo de
Montanide ISA-50 para la formulación de vacunas de
micoplasmas.

Resulta de suma importancia que las emulsiones para
vacunas permanezcan estables por largos períodos de
tiempo. Un
factor que dice cuán estable es o no una emulsión
es el tamaño de las partículas que forman la fase
dispersa, en este sentido, Muller y Heihemann (1992) prepararon
emulsiones con diámetros de hasta 5 m m y como resultado obtuvieron que aquellas
emulsiones con mayor número de glóbulos con
diámetros de 2 m m poseen
más estabilidad que las que contienen mayor cantidad de
glóbulos con diámetros entre 1 y 5 m m. Por lo que para incrementar la estabilidad
de emulsión vacunal (w/o), se deben obtener tamaños
de gotas iguales o menores de 2 m m,
lo cual depende entre otros factores del tiempo de
emulsificación y de la velocidad de
rotación del homogeneizador (Catálogo SEPPIC, 1993;
Enríquez et al., 1995). Por otra parte, este tamaño
de gota permite la difusión del antígeno en el
animal inyectado hasta alcanzar de forma rápida y
sistemática el tejido linfático y así
desencadenar la respuesta inmune en el animal (Morris,
1999).

Existen varios métodos para conocer si una
emulsión es o no satisfactoria, éstos consisten en
controlar durante la fabricación de la vacuna factores
tales como: la apariencia general de la emulsión, la
sedimentación de la fase dispersa y la separación
de la fase acuosa a través de pruebas aceleradas para
estimar la estabilidad de las vacunas. Una de estas pruebas
consiste en colocar las muestras a 37°C y a 56°C y
verificar el tiempo que permanecen sin rotura de emulsión;
la otra técnica descrita es la prueba de
centrífuga, la cual consiste en centrifugar las muestras a
3 000 rpm durante 1 hora, considerando para ambas pruebas que el
producto es estable si no se observa separación de
líquido acuoso en el fondo del tubo, es decir, que no haya
rotura de la emulsión (OPS, 1987; Enríquez et al.,
1995).

2. Controles del
producto final obtenido

En la Tabla 1 se pueden observar los controles
propuestos para la evaluación
del Producto Final según lo recomendado por el Manual OIE
(1996).

Tabla 1. Controles de calidad y criterios de
aceptación para la evaluación de una vacuna
inactivada oleosa contra M. gallisepticum.

3. Medidas de
protección y tratamiento de los desechos en un proceso de
obtención de una bacterina contra M.
gallisepticum

En la definición de una tecnología es
importante la consideración del medio
ambiente, en tal sentido podemos decir que M.
gallisepticum es microorganismo que se ubica en el grupo de
riesgo II
(riesgo individual moderado y comunitario limitado), que puede
provocar la enfermedad a las aves; pero
tiene pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave al
personal de
laboratorio,
la comunidad o al
medio ambiente.
Teniendo en cuenta esto, se deben disponer de medidas eficaces de
tratamiento y prevención.

En el laboratorio se debe trabajar bajo gabinetes de
bioseguridad y usar ropa sanitaria completa, la que debe
cambiarse después de concluido el trabajo,
desinfectarse las manos con alcohol (70%)
y posteriormente lavarlas.

Concluida cada etapa del proceso, los equipos utilizados
en la misma deben ser descontaminados por calor
(121°C) durante 1 hora, los residuales pasarán a un
tanque y comprobada la completa inactivación del
microorganismo se desecharan.

4.
Evaluación económica de un proceso de
obtención de una vacuna contra M.
gallisepticum

Una vez que se plantea una variante factible desde el
punto de vista tecnológico, debe ser sometida a un
análisis complementario donde se demuestre
la efectividad económica de la propuesta. En este
análisis es fundamental la determinación del
costo de
producción y el beneficio producido por la
vacunación pues el costo de una
vacuna nunca deberá exceder las pérdidas en que se
incurre por concepto de la
enfermedad (Barreras, 2000).

Para decidir si la alternativa estudiada puede ser
escogida por la empresa, debe
calcularse su costo de inversión, su comportamiento
en el flujo de caja,
así como el plazo de recuperación de la
inversión. En este análisis es fundamental la
determinación del costo de producción, que es el
conjunto de gastos
económicos en que incurre una planta o proceso industrial,
durante un período de tiempo dado, como consecuencia de la
utilización de recursos materiales y
humanos, que tienen lugar durante el proceso de
elaboración de los productos
terminados.

El costo de producción está constituido
fundamentalmente por los siguientes elementos:

• Costo de la materia
  prima y materiales de producción.
• Costo de mantenimiento o
  reparación.
• Costo de la fuerza de
  trabajo utilizada en el proceso productivo.
• Depreciación.
• Costo de facilidades auxiliares.
• Costo de suministros de operación.
• Costos generales.
• Costo de administración o dirección.

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*Autor correspondiente:

Tania Pérez Bueno

(Investigador Auxiliar)

Edad: 36 años

Estudios realizados:

• Ingeniería Química. Instituto
  Superior Politécnico "José A.
  Echeverría" (CUJAE), Cuba, 1993.
• Master en Ingeniería de los Procesos
  Biotecnológicos. Centro de Ingeniería
  Genética y Biotecnología (CIGB), Cuba,
  1996.
• Doctor en Ciencias Técnicas. CUJAE, Cuba,
  2002.

Sánchez M., Lilian

Rosado R., Ileana

Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria
(CENSA)

Carretera de Jamaica y Autopista Nacional. Apartado 10
San José de Las Lajas.

La Habana, Cuba.

Tel. (+53-47) 86 3653, fax (+53-47)
86 3206.

Categoría: Agricultura y
Ganadería