Evaluación de extractos
diversos de ambos en la viabilidad y expresión fimbrial de
Escherichia coli enterotoxigénica.
RESUMEN
El trabajo
analiza las causas que motivaron los resultados contradictorios
precedentes en cuanto a la expresión fimbrial de K88 y la
viabilidad de E. coli G7 frente a extractos de
Eucalyptus. En la experiencia se utilizaron 8 cepas
entéricas (7 de referencia K88+ y una cepa salvaje CFA/I
+). Se ensayaron 10 extractos (5 decocciones, 3 infusiones y 2
extractos acuosos) de Eucalyptus citriodora y
Eucalyptus saligna elaborados a diferentes
concentraciones.
Se pudo comprobar que el efecto sobre la viabilidad
depende de la especie de Eucalyptus, la
concentración del extracto y la cepa bacteriana tratada.
Ninguno de los extractos de E. citriodora tuvo acción
sobre la viabilidad bacteriana. En los elaborados a partir de
E. saligna este efecto fue proporcional a la
concentración. El efecto inhibitorio de los extractos
sobre K88 está relacionado con la especie de
Eucalyptus y la concentración de los extractos.
Todos los extractos que inhibieron K88 tuvieron un comportamiento
semejante sobre CFA/I. El trabajo
propone un modelo para el
estudio de extractos de plantas que
afecten la expresión fimbrial en el que los
fenómenos de autoaglutinación no interfieren y no
es imprescindible la utilización de técnicas
de microscopia electrónica.
ABSTRACT
Causes provoking contradictory results concerning
Eucalyptus extracts effects upon K88 fimbrial expression
and viability in E. coli G7 are discussed. Eight enteric
strains (seven from K88+ and one wild trait CFA/I+) were studied.
Ten extracts (five decoctions,
three infusions, and two aqueous extracts) from E.
citriodora and E. saligna prepared at different
concentrations were analyzed. It was confirmed that extract
effect upon viability depended on Eucalyptus species,
extract concentration values, and bacterial strain under
treatment. No E. citriodora extracts affected bacterial
viability. E. saligna extract effect depended on
concentration values. Extract inhibitory effect upon K88 depended
on Eucalyptus species and extract concentration values.
All extracts inhibiting K88 showed a similar effect upon CFA/I. A
model to study plant extracts affecting fimbrial expression is
suggested. This model does away with self-agglutination phenomena
interferences and the use of electronic microscope
techniques.
PALABRAS CLAVES: E. coli, E. coli
enterotoxigénica, Eucalyptus, diarrea,
fimbrias
INTRODUCCIÓN
Las diarreas
constituyen un serio problema para la salud humana y animal. En
las debidas a Escherichia coli enterotoxigénica
(ECET) la colonización del intestino delgado constituye un
paso previo imprescindible que tiene lugar gracias a la
adhesión bacteriana a receptores del epitelio intestinal
del hospedero. Se trata de una unión específica en
la que participan estructuras
bacterianas denominadas factores de colonización
(Ørskov y Ørskov, 1983), destacándose entre
ellas las fimbrias (Padilla et al., 1988).
En los últimos años diversas experiencias
han tenido como objetivo el
bloqueo de la adhesión mediante la elaboración de
vacunas
antifimbriales (Levine, 1990; Idania Wong et al., 1992,
1995, 1996, Moon y Bunn, 1993) y el empleo de
determinados antibióticos en concentraciones subletales
(Barreto et al., 1994), entre otros (Isaacson,
1980).
El Eucabev es un medicamento elaborado a partir de
corteza de Eucalyptus para el tratamiento de la enfermedad
diarreica aguda (EDA) en diversas especies animales, y
el hombre
(Berta Velásquez et al., 1991). Los reportes sobre
la acción antimicrobiana de esta planta son muy
contradictorios (Roig, 1974; Dellacassa et al., 1989;
Niurka Sóñora et al., 1992; Misleidi
Martín et al., 1993; Barreto et al., 1993b).
Ensayos a
partir de decocciones de corteza mostraron que las mismas
carecían de acción bactericida y/o
bacteriostática, al menos en concentraciones semejantes a
las empleadas en el Eucabev (Niurka Sóñora et
al., 1992; Misleidi Martín et al., 1993;
Barreto et al., 1993; Barreto et al., 1995a). Estos
resultados conllevaron a pensar que la acción de este
medicamento estuviera relacionada con un bloqueo de la
adhesión fimbrial, aspecto que se demostró en
un ensayo que
involucró a las cepas de referencia G7 (08K87, K88ab) y
B44 (portadora de la fimbria K99) (Barreto et al., 1993a).
Sin embargo, en trabajos posteriores, se obtuvieron resultados
contradictorios en lo relativo a la adhesina K88 (Misleidi
Martín et al., 1993; Barreto et al.,
1995a).
El factor de colonización K88, además de
prevalecer en las ECET que afectan a cerdos neonatos y
postdestetados (Idania Wong et al., 1995, 1996), se ha
caracterizado por mostrar una mayor estabilidad que las restantes
estructuras de adhesión estudiadas en Escherichia
coli (Barreto et al., 1993a) en tanto que la adhesina
CFA/I es la más frecuente en cepas de ECET aisladas en
pacientes de enfermedad diarreica aguda (Blanco y Blanco, 1993;
Barreto, 1996). Esta entidad es la principal causa de EDA en los
países en vías de desarrollo y
se ha asociado a brotes de importancia en países
desarrollados (Blanco et al., 1996; Roels, 1998; Mitsuda
et al., 1998; Nishikawa et al., 1998) Teniendo en
cuenta lo anteriormente expuesto, este trabajo ha tenido como
objetivos:
– Determinar las causas que han motivado un
comportamiento contradictorio en la expresión de K88 y la
viabilidad bacteriana de E. coli frente a extractos de
corteza de Eucalyptus.
– Efectuar un estudio preliminar sobre la acción
de estos extractos en la expresión de la fimbria
CFA/I
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas
En la tabla 1 se recogen las principales
características de las cepas utilizadas en la investigación.
Medios de cultivo
Se utilizaron los medios de
cultivo: caldo Müeller Hinton y agar Müeller Hinton
(OXOID, Gran Bretaña). En los ensayos en que se
evaluó la acción inhibitoria de los extractos sobre
la expresión de las fimbrias K88 y CFA/I se prepararon con
el 50% del agua
requerida, en el caso de los extractos 1; 2; 4; 6; 7 y 8, y con
el 85% para los extractos 3; 5; 9 y 10. Luego de la
esterilización se completó el volumen faltante
con los extractos correspondientes, después de ser
filtrados cada uno a través de filtros de Policarbonato
Sartorius (SM 16508 B) para garantizar su esterilidad.
Inmunosueros
En las experiencias para determinar la acción
inhibitoria de los extractos sobre la fimbria K88 se
utilizó un inmunosuero anti-K88 de conejo policlonal
monoespecífico. En el test de ELISA, utilizado para
investigar las variantes autoaglutinantes, se emplearon,
además del anterior, el anticuerpo monoclonal 11/70
antiK88ab y un conjugado anti-IgG de conejo en
carnero.
Hematíes
Se utilizó sangre humana A
en suspensión salina buferada (PBS) en proporción
1:4 y a pH 7,2 para
los ensayos de hemoaglutinación manosa-resistente (Blanco
y Blanco, 1993).
Extractos
El material vegetal fue secado en estufa con
recirculación de aire a 40 0C
durante 7 días. Luego fue reducido a polvo utilizando un
molino con refrigeración por aire. Las decocciones se
prepararon hirviendo el material vegetal en agua durante diez
minutos. Pasado ese tiempo se
dejó enfriar y se separó el material vegetal del
líquido mediante filtración. Para las infusiones,
se añadió el agua
hirviendo sobre el material vegetal, se dejó reposar
durante quince minutos, se enfrió y se separó el
material vegetal de la infusión por filtración. En
ambos casos, al final, se restituyó el volumen inicial
mediante adición de agua destilada estéril. Los
extractos acuosos fueron preparados por adición de agua
destilada estéril al material vegetal, se maceró
durante 24 horas, a 30 ºC y pasado ese tiempo se
filtró para separar el material vegetal del extracto
obtenido.
Las características de los extractos obtenidos
por los métodos
anteriormente descritos se recogen en la tabla 2. A cada extracto
se le asignó un número, y con esa
designación se utilizaron en la investigación sin
que se conocieran sus particularidades.
Efecto de los extractos de Eucalyptus sobre la
viabilidad bacteriana
Se utilizaron 8 cepas (todas caracterizadas en la tabla
1). El ensayo se
realizó en placas Petri de 100 mm de diámetro a las
que se adicionó 20 mL de agar Müeller-
Hinton en la siguiente forma: una primera capa (10 mL)
con una concentración de agar-agar al 1,7%, a la que se
agregó, una vez solidificada, una segunda capa (10 mL) con
agar-agar al 1%. Cada placa se sembró por hisopaje a
partir de las suspensiones bacterianas en agua destilada
estéril, según lo establecido por Kirby y Bauer
(Bio-Merieux, 1984). Con perforador se efectuaron,
asépticamente, diez excavaciones en la capa superior de
cada placa y, con el auxilio de una pipeta Eppendorf, se
adicionó 25 µl de cada extracto en la
excavación correspondiente. Todas las placas se incubaron
a 37 ºC durante 24 horas. La experiencia constó de 3
réplicas. Se realizó un ensayo
preliminar para determinar los extractos que inhibían la
expresión de K88 en E. coli G7. Una vez
establecidos los mismos, se repitió el ensayo con E.
coli G7 y E. coli 158. Tanto en la experiencia
preliminar como en la segunda se procedió de acuerdo a
Barreto et al. (1993). El ensayo segundo contó con
5 réplicas en las experiencias realizadas con la cepa
G7.
Confirmación de K88 en las variantes
autoaglutinantes
A una parte de las variantes autoglutinantes de E.
coli G7 se le investigó la presencia de K88 mediante
un test de ELISA tipo Sandwich (Ana Campal et al.,
1992).
Procesamiento Estadístico
A los resultados que se entendió pertinente se
les aplicó el método de
comparación de proporciones.
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