2. Métodos de
detección de polimorfismo genético
La variación de naturaleza
cuantitativa y de origen genético dentro de las
poblaciones se presenta en dos formas básicas: mutantes
raros y polimorfismo genético. Atendiendo al valor de la
frecuencia, si la variante más escasa aparece con una
frecuencia menor del 1% se denomina mutante raro, pero si
ésta es mayor que este valor estamos en presencia de un
polimorfismo genético (Clarke, 1975). Así pues,
Berovides y Alfonso (1987) definieron este último como la
ocurrencia dentro de una población de variantes discontinuas de
origen genético, con una frecuencia del gen que no puede
ser explicada por la acción
exclusiva de mutaciones, por ser este un evento sumamente
raro.
La variabilidad genética
es un atributo que no puede ser exhaustivamente medido. Es
imposible examinar cada gen en cada individuo de
una especie dada para obtener una enumeración completa de
la variación genética de la especie; sin embargo,
si se toma una muestra de una
población es posible estimar su variabilidad
genética (Ayala, 1984), al utilizar un carácter o marcador que propicie la
medición de dicha variabilidad.
El polimorfismo genético o variación de
origen genético ha sido muy estudiado en poblaciones
naturales, pues permite el análisis de fenómenos como cantidad
de variabilidad genética y frecuencia de mutaciones a
través de caracteres de fácil medición y de
base genética conocida, con poca influencia del ambiente en su
expresión fenotípica (Berovides y Alfonso,
1987).
Hasta mediados de la década de los 60?, los
marcadores usados en genética y mejora animal estaban
controlados por genes asociados a caracteres polimórficos,
en general fáciles de identificar visualmente (Ferreira y
Grattapaglia, 1995). Pero solo un pequeño número de
marcadores morfológicos permitían encontrar
asociaciones significativas entre estos y los caracteres con
importancia económica. Por sus limitaciones surgieron los
marcadores isoenzimáticos que eran accesibles a un mayor
número de especies y brindaban mejores
resultados.
Con el advenimiento de las técnicas
de biología
molecular aparecieron diversos métodos de detección
de polimorfismo genético directamente a nivel de ADN. Inicialmente
el descubrimiento de las enzimas de
restricción permitió el análisis de los
polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción
(Grodzicker et al., 1974).
Posteriormente, con el desarrollo de
la reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain
Reaction (PCR), Mullis y Faloona, 1987; Saiki et al.,
1988), se desarrollaron nuevos métodos de detección
de marcadores
moleculares; estos últimos se definen como todo aquel
fenotipo molecular proveniente de un gen expresado, como en el
caso de las isoenzimas o las proteínas
(marcadores bioquímicos), o de un segmento
específico de ADN (correspondiente a regiones expresadas o
no del genoma) (Ferreira y Grattapaglia, 1995).
En las determinaciones de la variabilidad
genética, los marcadores "ideales" cumplen una serie de
características, entre las que se encuentran: elevada
capacidad de detectar altos niveles de polimorfismo, alta
heredabilidad, gran capacidad para acceder a todas las regiones
del genoma, independencia
del estado
físico y de desarrollo del individuo, facilidad de
obtención, detección por métodos
económicos, independencia de las condiciones ambientales y
la posibilidad de determinación en cualquier tipo de
células
que contenga núcleo (Ferreira y Grattapaglia, 1995). Estas
constituyen algunas de las ventajas de los marcadores moleculares
sobre los morfológicos e isoenzimas; otras radican en su
capacidad de detección de mutaciones silenciosas, que no
originan cambios de aminoácidos.
Los polimorfismos detectados en el ADN están
ocasionados por diferencias en cuanto al número de
determinadas regiones no codificantes, que se encuentran
dispersas en el genoma (regiones repetidas) o por mutaciones
puntuales. En función de
estas características se pueden clasificar los diferentes
métodos de detección de polimorfismos: los
marcadores asociados a variaciones debidas al número
de repeticiones en su secuencia y los marcadores que
detectan cambios puntuales en el genoma, que pueden ser
detectables o n, por enzimas de restricción.
2.1. Polimorfismos de longitud de secuencia simple
(SSLPs)
Los SSLPs son arreglos de secuencias repetidas que
muestran variaciones en su longitud, con alelos que difieren en
el número de unidades repetidas, pueden ser
multialélicos y cada SSLP puede tener un número de
variantes de longitudes diferentes; existen dos tipos de estos
marcadores que se clasifican como DNA satélite, aunque no
aparezcan con bandas "satélite" en gradiente de densidad:
- Minisatélites, también conocidos como
repeticiones en tandem de número variable (variable
number of tandem repeats (VNTRs)), en los cuales la
unidad repetida es de hasta 25pb de longitud. - Microsatélites o repeticiones simples en
tandem (simple tandem repeats (STRs)), cuyas
repeticiones son menores, usualmente de unidades de
dinucleotidos o trinucleotidos.
Los microsatélites son más populares que
los minisatélites como marcadores moleculares por dos
razones: primero los minisatélites no se encuentran
repartidos por todo el genoma, encontrándose
fundamentalmente en las regiones teloméricas al final de
los cromosomas.
En términos geográficos, esto es
equivalente a intentar utilizar un mapa de faros para encontrar
una casa alrededor del centro de una isla. Los
microsatélites están más convenientemente
espaciados a través del genoma. Segundo, la vía
más rápida de tipificar el polimorfismo de longitud
es por PCR, pero esta técnica es mucho más exacta
cuando se amplifican secuencias de longitud menor a 300pb. La
mayoría de los alelos de minisatélites tienen
tallas superiores debido a que sus unidades de repetición
son relativamente grandes y con una sola copia, por lo que se
requerirían productos de
PCR de varias kb para tipificarlos. Los microsatélites
típicos constan de 10-30 copias de una repetición
que usualmente no son superiores a 4pb de longitud, por lo tanto
son mucho más fáciles de analizar por
PCR.
2.1.1. Marcadores basados en loci
hipervariables de minisatélites (VNTR)
Se conoce que una gran proporción variable del
genoma eucariota está compuesto por secuencias repetitivas
de ADN, las cuales difieren en el número y la
composición de nucleótidos. Los primeros marcadores
de este tipo en ser utilizados fueron los minisatélites o
VNTR ("Variable Number of Tandem Repeats") (Jeffreys et
al., 1985), que están ubicados en regiones
centroméricas y teloméricas de los cromosomas
(Moyzis et al., 1988). Están constituidos por un
número variable de secuencias idénticas repetidas.
Estas poseen de 15 a 100 pares de bases y en cada locus
hipervariable están repetidas hasta 50 veces.
El nombre de minisatélites se debe al hecho de
que las secuencias repetitivas forman un pico satélite
diferente al pico principal de ADN genómico después
de la separación en gradientes de cloruro de cesio, por
contener una proporción de pares de bases G+C diferente a
la media del resto del genoma (Lewin, 1997). De esta
observación surgió el concepto de
huella dactilar genética o "genetic fingerprint" y este
tipo de marcador constituyó durante un tiempo la base
genética de la identificación de
individuos.
Los minisatélites están asociados con
características estructurales de los cromosomas. El DNA
telomérico, que en humanos comprende cientos de copias con
el motivo 5´-TTAGGG-3´ es un ejemplo de
minisatélite, de cuyo origen y función se conoce
algo y que están relacionados de manera importante en el
proceso de
replicación. Existen otros ejemplos de genomas eucariotas
que contienen varios cluster de minisatélites, de los
cuales la mayoría, aunque no todos se ubican al final de
los cromosomas, cuyas funciones
aún no se conocen totalmente (Strachan y Read,
1999).
El principio genético de la obtención de
estos marcadores se basa en la digestión del ADN de los
individuos analizados con enzimas de restricción, separado
electroforéticamente, inmovilizado en una membrana y
detectado por hibridación con sondas y
autorradiografía (Figura 1). Cuando la enzima de
restricción corta las secuencias adyacentes a un
locus hipervariable, la longitud de los fragmentos de
restricción producidos en diferentes individuos
varía con el número de repeticiones del
minisatélite, resultando en un patrón e bandas
específico para cada indoviduo.
Esta variación del número de elementos
repetidos se genera posiblemente debido a fenómenos como
deslices en la replicación del ADN o aún en la
conversión génica (Jeffreys et al., 1985).
Por este método se
pueden detectar gran polimorfimo, que depende de la
variación en la distribución de los sitios de
restricción y el número de secuencias repetidas
(Cornide et al., 2002).
Estos se han utilizado cada vez menos, debido a causas
como la gran complejidad de la técnica y su elevado
costo, que
limitan su utilización, por ejemplo, para la
detección de genes ligados a loci de rasgos
cuantitativos ("Quantitative Traits Loci", QTL):
loci con una gran influencia sobre rasgos comercialmente
importantes, marcados por polimorfismos de ADN, cuya
variación puede ser empleada en la selección,
de forma semejante a los genes simples y que se caracterizan por
estar ligados a marcadores genéticos (Distl,
2000).
2.1.2. Marcadores basados en la
amplificación de microsatélites
Los loci microsatélites (Litt y Luty,
1989; Koreth et al., 1996), también conocidos como
SSR ("Simple Sequence Repeat": Secuencias Simples Repetidas),
consisten en pequeñas secuencias con 2-6
nucleótidos repetidos en tándem, altamente variables en
tamaño, en un rango alrededor de los 100-200pb. En genomas
eucariotas las secuencias de los microsatélites son muy
frecuentes, bien distribuidas y mucho más
polimórficas que los loci hipervariables formados
por minisatélites, constituyendo la clase de
marcadores moleculares más polimórficos que se
conocen (Ferreira y Grattapaglia, 1995, Cornide et al.,
2002). Se ha señalado que los elementos más
repetidos en mamíferos son extensiones de
dinucleótidos CA.
Por el momento, se desconoce exactamente el origen y la
función de estas secuencias repetidas. Respecto a su
origen, la aparición inicial de los microsatélites
pudo deberse al azar, o podrían haber surgido como
producto de
mutaciones en la secuencia poli-A en el extremo 3? de las
secuencias Alu adyacentes. Por otra parte, la prevalencia
selectiva de CA puede explicarse por metilación de los
residuos de citosina en el extremo 5? de GC, secuencias
normalmente presentes en el genoma. Por último, los
residuos metilados pueden ser desaminados produciendo una
transición C/T (Koreth et al., 1996).
En relación con su función, se cree que no
son más que un reflejo interno de mecanismos
genómicos con tendencia a producir y cortar estas
secuencias (, y existen evidencias de
que no son necesarios para la expresión génica
(Stalling, 1994). Anteriormente se habían propuesto como
puntos calientes en la recombinación genética, en
los cuales se producen entrecruzamientos con intercambios
desiguales de cromátidas (Weber y May,
1989) y como reguladores de genes (Hamada et al., 1984).
Por último, Kashi et al., (1997) lanzaron la
hipótesis de que los microsátelites
son una fuente de variación cuantitativa.
Estos autores se basaron en una serie de
características de estas regiones como son su
dispersión a lo largo del genoma, su asociación a
genes como elementos de control de
transcripción o como componentes codificantes, las
variaciones observadas en el número de repeticiones que
pueden causar cambios cuantitativos en la expresión
génica y función, así como cambios
fenotípicos, entre otras. Así, el cambio en el
número de repeticiones puede ser un medio exquisitamente
específico y sensible de regulación cuantitativa de
variación.
Esta fuente de mutación y cambio en el
número de repeticiones podría proveer una fuente de
variación cuantitativa para una rápida
adaptación evolutiva de las especies a cambios
ecológicos. Así, se ha descrito (Rosenberg et
al., 1994) que la nutrición y el
estrés
podrían incrementar la velocidad de
mutación en los microsatélites debido a un descenso
de la regulación de reparación de errores. De esta
forma, el estrés que acompaña al cambio evolutivo
podría inducir en una población el incremento de
mutaciones requeridas para adaptarse al cambio.
Los microsatélites han demostrado ser los
marcadores más informativos para estudios poblacionales a
nivel de subespecie. La mayoría de los estudios realizados
hasta el momento con este tipo de marcadores se basa en el
análisis de frecuencias alélicas, con la finalidad
en un principio de la creación de mapas
genéticos y posteriormente para la determinación de
QTLs (Georges et al., 1995; Velmala et al.,
1999).
Weber y May (1989) propusieron la PCR como método
general para el estudio del polimorfismo de estas regiones, las
que se amplifican individualmente utilizando un par de
oligonucleótidos específicos (20-30mer)
complementarios a las secuencias únicas que flanquean el
microsatélite (figura 2). Los fragmentos amplificados,
casi invariablemente, presentan un polimorfismo extensivo
resultante de la diferencia en el número de elementos
simples repetidos. Así, cada región
microsatélite, independientemente de la secuencia
repetida, constituye un locus altamente variable,
multialélico y de gran contenido informativo.
Figura 2. Esquema que ilustra la
composición de una región microsatélite en
una cadena de ADN
Cada segmento amplificado representa un alelo diferente
del mismo locus. La detección de estas secuencias
se ha realizado en geles de poliacrilamida altamente resolutivos
debido a que las diferencias entre uno y otro alelo pueden ser de
uno o dos nucleótidos y más recientemente en
secuenciadotes automáticos utilzando fluoróforos
diferentes para cada microstélite (figura 3) (Womack,
1993). Además, pueden analizarse muchos genotipos
simultáneamente por ser los marcadores más
adecuados para el desarrollo de mapas de ligamiento.
Figura 3. Análisis de
genotipos de microsatélites marcados con
fluorescencia
Debido a la importancia que estos marcadores han tomado
en el desarrollo de mapas genéticos, las formas de
detección son muy variables y constantemente aparecen
nuevas técnicas. En un primer momento se pueden dividir en
dos: unas basadas en el análisis de las bases de datos de
los genes existentes y otras en su detección en el
laboratorio.
La búsqueda en bases de datos como EMBL,
GenBank, etc., han permitido caracterizar algunos
microsatélites bovinos (Fries y et al.., 1993).
Actualmente la mayoría de los estudios de detección
de microsatélites tiene lugar en el laboratorio.
Inicialmente se trabajaba en el monitoreo de una librería
de ADN genómico bovino (clones bacterianos con distintos
fragmentos de ADN) mediante sondas de dinucleótidos (ej.
(TG)n y (CA)n) marcadas con 32P
y posteriormente se realizaba la secuenciaón de los clones
positivos. Utilizando esta metodología se han detectado un gran
número de microsatélites en esta especie (Vaiman
et al., 1992; Kemp et al., 1993).
Por las ventajas que poseen estos marcadores, se ha
trabajado ampliamente en la búsqueda y empleo en
diferentes especies de interés en
ganadería,
tales como ovino (Buchanan et al., 1998; Dietz et
al., 1993), caprino (Kemp et al., 1995), porcino
(Moran, 1993), bovino (Fries et al., 1990; Vaiman et
al., 1992; Usha et al., 1995; Giovambatista et
al., 2000; Hansen et al., 2002) , etc. Se han
realizado estudios en distintas especies ganaderas y por supuesto
en bovinos (MacHugh et al., 1994; Ciampolini et
al., 1995; Moazami-Goudarzi et al., 1997;
Martín-Burriel et al., 1999; Rusell et al.,
2000; Uffo, 2003) que han tomado como base las investigaciones
realizadas relacionadas con la caracterización de
poblaciones humanas.
2.2. Marcadores que presentan cambios puntuales en el
genoma.
2.2.1 Marcadores moleculares basados en el
polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción
(RFLP)
A finales de la década del ?60 el descubrimiento
de las endonucleasas de restricción de bacterias
(enzimas de restricción con muy alta especificidad), las
cuales cortaban el ADN en secuencias definidas de usualmente
4-8pb, conllevó al desarrollo de técnicas para el
aislamiento y la manipulación dirigida de fragmentos de
ADN. Una de las mayores aplicaciones de esta técnica
(ampliamente utilizada en el campo de la genética humana)
fue el ensamblaje de los mapas genéticos con el
polimorfismo en la longitud de los fragmentos de
restricción (Restriction Fragments Length Polymorphism,
RFLP) (Grodzicker et al., 1974).
Esta técnica explota las variaciones en las
secuencias del ADN por la creación o abolición de
sitios para el corte de las endonucleasas de restricción,
dadas por los cambios de bases, las adiciones o deleciones de
fragmentos de ADN entre y en estos sitios. Además, algunas
endonucleasas son incapaces de cortar el ADN si la secuencia de
reconocimiento contiene uno o más sitios de citosina
metilada, por lo tanto tales enzimas pueden detectar polimorfismo
si hay variaciones en los patrones de
metilación.
El estudio de los polimorfismos de este tipo consiste en
el análisis en cuanto a número y tamaño de
los fragmentos de ADN al ser digeridos con distintas enzimas de
restricción. Los patrones de bandas resultantes se generan
por la presencia o ausencia de los sitios de corte de la enzima
producidos por mutaciones: cambios, delecciones o inserciones de
bases. Por lo tanto, la variabilidad está dada por las
distintas tallas de los fragmentos que se originan al digerir con
las mencionadas enzimas el material genómico o un
fragmento amplificado del genoma, de manera que un sitio de
restricción polimórfico o una delección o
inserción entre dos sitios de corte será detectado
como un polimorfismo en la longitud de los fragmentos de
restricción generados a nivel fenotípico (Botstein
et al., 1980).
La técnica consta de las siguientes etapas
(figura 4): digestión del ADN con enzimas de
restricción; separación por electroforesis de los
fragmentos resultantes de la digestión; transferencia de
los fragmentos separados a membranas de nitrocelulosa (Southern
Blotting) e hibridación con sondas moleculares radiactivas
y exposición de la membrana a un filme de
rayos X. La
identificación delpolimorfismo también puede
hacerse por PCR (Leveziel et al., 1988; Cornide et
al., 2002). Este método se ha empleado en la
caracterización de los genes de algunas de las
proteínas lácteas bovinas (Rodellar et al.,
1992; Osta, 1994; Uffo 2002a y b, 2003).
Figura 4: A: Representación
esquemática del principio genético del
RFLP.
B: Gel de azarosa 1.5% teñido con bromuro de
etidio contenieno los productos obtenidos de ADN de diferentes
individuos, amplificados por PCRy digeridos con la enzima
TaqI, M: marcador de peso molecular de 1Kb
El uso de los RFLP como marcadores para trazar la
transmisión de los genes asociados a ellos, es de una
utilidad
considerable en genética pues tienen como ventajas el no
estar influenciados por el ambiente, no depender del estado
ontogénico del animal, permitir un análisis de todo
el genoma, poder ser
detectados en estadios muy tempranos del desarrollo
independientemente de la expresión del gen, una vez
heredados, y además poseen la característica de ser
codominantes en la expresión fenotípica, es decir,
permiten discernir entre el individuo homocigótico
dominante y el heterocigótico; son muy comunes y cualquier
gen debe tener sitios de restricción polimórficos
en una vecindad de varios cientos de pares de bases.
Pero tienen como desventajas que son muy costosos,
necesitan de un personal
calificado y entrenado para trabajarlo, precisan el uso de
radioactividad y además, consumen mucho tiempo (Asmussen y
Clegg, 1985; Ferreira y Grattapaglia, 1995).
En animales
domésticos se ha realizado este tipo de análisis
del ADN desde 1985, con numerosos trabajos en una amplia
diversidad de especies: perros (Jeffreys
et al., 1987); cerdos (Davies et al., 1988); gatos
(Hillel et al., 1989); cabras (Bergensen, 1990); ovinos
(Leveziel et al., 1991); bovinos (Rodellar et al.,
1992, Uffo, 2003); aves
(Bumstead, et al., 1992; Cheng, 1997). En la actualidad su
mayor utilización se basa en la combinación con la
técnica de PCR
Otras de las aplicaciones de esta tecnología ha sido el
desarrollo de detallados mapas de ligamiento en una amplia
variedad de organismos. Aunque ésta es la más
conocida, el RFLP se ha empleado también en la
caracterización del genoma de organelos, en la
identificación de líneas o individuos y en las
investigaciones sobre el tema de la diversidad genética
(Tanksleet al., 1989; Van der Beek et al., 1992;
Uffo, 2003).
La identificación y el mapeo de RFLPs han
revolucionado la genética humana por el desarrollo del
diagnóstico asistido por marcadores y la
detección de una amplia variedad de enfermedades hereditarias. A
pesar de haber sido ignorados este tipo de marcadores en sus
inicios por los genetistas veterinarios, los mismos
métodos para el mapeo en humanos son empleados para
estudios de diferentes especies animales, respecto a los sitios
polimórficos, produciéndose una revolución
en el mejoramiento animal por la introducción de la selección
asistida por marcadores (Marker Asisted Selection: MAS) (Womack,
1983).
2.2.2. Oligonucleótidos alelos
específicos ("Allele Specific Oligonucleotides",
ASOs)
Su metodología de identificación consiste
en la detección de la variabilidad mediante sondas
específicas para los alelos. Pueden usarse marcados con
radiactividad para detectar la variabilidad en un "dot blot" tras
una amplificación (Pinder et al., 1991) o como
oligonucleótidos para PCR que amplificarán un alelo
específicamente (Leveziel et al., 1994; Okimoto y
Dogson, 1996; Braunschweirg et al., 1999).
Presentan el inconveniente de que cuando se usan sondas,
cada análisis deberá realizarse tantas veces como
alelos sean detectados, ya que cada sonda será capaz de
reconocer si el alelo está presente o no, pero no se puede
determinar el genotipo del animal.
El procedimiento
general de dot-blot involucra tomar una solución acuosa
del ADN blanco, por ejemplo ADN genómico total bovino, y
simplemente depositarlo en forma de manchas ("spot") sobre una
membrana de nitrocelulosa o de nylon, dejándolas secar. El
ADN blanco se desnaturaliza, ya sea por exposición al
calor o por
tratamiento con álcalis; luego una vez inmovilizado sobre
la membrana, este se expone entonces a una solución que
contiene las sondas marcadas.
Después transcurrido un determinado tiempo de
reacción que permita la formación de los
heteroduplex "sonda-blanco", se elimina la solución de la
sonda, se lava la membrana para eliminar el exceso de sonda
marcada que haya quedado sin reaccionar o que pueda constituir
enlaces inespecíficos con la membrana y finalmente, esta
se seca y se expone a una película de
autorradiografía.
Para el uso de esta técnica en la
detección de alelos específicos, se construyen
sondas que abarcan las diferentes variantes de un sitio de
interés. Así las sondas ASO tienen una longitud
entre 15 y 20 nucleotidos, y normalmente se utuilizan bajo
condiciones de hibridación a las cuales el duplex entre
estas y el ADN blanco es estable solo si existe una
complementariedad perfecta entre sus secuencias; un simple error
de complementariedad puede producir un heteroduplex
pequeño e inestable. Típicamente, esto involucra el
diseño
de oligonucleotidos en los cuales la diferencia entre los alelos
se identifica con un nucleotido ubicado en el segmento central de
su secuencia, de tal modo que se maximisa la inestabilidad de un
duplex mal ensamblado. Esta propiedad de
discriminación puede usarse en una gran
variedad de objetivos de
investigación y diagnóstico. Un
ejemplo de esto lo constituye la identificación de
individuos con anemia
falciforme o siclemia. En la figura 5 aparece la
representación esquemática del alelos normal de la
-globina (arriba) (A-ASO; se muestra
inmediatamente debajo).
Los resultados son positivos cuando se identifican
individuos normales o heterocigóticos (círculos
negros) y negativos cuando se encuentran individuoa
homociigóticos recesivos (círculos en blanco). El
dot-blot de abajo muestra la identificación de la
mutación cuando se utiliza un oligonucleotido
específico para la misma (S-ASO; se
muestra inmediatamente debajo), y en este caso resulta que el
individuo es positivo cuando son heterocigotos u homocigotos
recesivos (círculos azules) y negativos cuando son
normales. Las sondas A-ASO y
S-ASO en este caso fueron diseñadas de
manera tal que tuvieran 19 nucleotidos de longitud, abarcando de
los codones 3 al 9 de las secuencias del gen de la
A y S globina,
respectivamente, alrededor del sitio de mutación. Este es
una sustitución de un nucleotido simple (A
T) en el codón 6 del gen de la
-globina, resultando en una sustitución de
GAG (Glu) GTG (Val) (se observa en la
secuencia central) (Strachan y Read, 1999).
Figura 5. Identificación de
oligonuclótido alelo específico (ASO) por
hibridación de dot-blot (ejemplo: identificación de
individuos con siclemia).
Otro método de identificación de ASOs por
dot-blot utiliza unan aplicación inversa. Esto significa
que las sondas de oligonucleotidos no estan marcadas y se fijan
sobre la membrana o el filtro mientras que el ADN blanco, esta
vez marcado, se coloca en solución. Las uniones positivas
del ADN blanco con el oligonucleotido específico sobre la
membrana se corresponden con la existencia de una secuencia
específica en el ADN blanco.
Esta aplicación se relaciona con el método
de microarreglos (microarrays) y actualmente tiene innumerables
aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades, sobre todo
en humanos, la cual es una técnica novedosa basada en la
utilización de genosensores o ADN-chips que contienen
cientos de sondas ordenadas y adheridas a la superficie, donde
posteriormente se hibrida la secuencia complementaria del ADN en
estudio. Se puede utilizar para el análisis de mutaciones
específicas o de polimorfismo, identificación de
especies, ene l análisis de la expresión
génica y para la secuenciación.
El uso más importante es el análisis de
marcadores polimórficos; si se conoce la secuencia
nucleotidica del fragmento polimórfico, entonces se pueden
incluir sondas específicas en el genosensor para cada
alelo delmarcador de ADN. El patrón de hibridación
producido con los fragmentos que contienen los maracdoresde
interés revelará rápidamente el genotipo
(Cornide et al., 2002)
2.2.3. ADN polimórfico amplicado al azar: RAPD
(Random Amplified Polymorphic ADN)
La técnica RAPD, conocida también como
AP-PCR (Arbitrary primed PCR, Welsh y McClelland, 1990) es
básicamente una variación del protocolo de la
PCR con dos características distintivas: utiliza un
cebador único en lugar de un par de primers y este tiene
secuencia arbitraria, por lo tanto su secuencia es desconocida,
se pueden seleccionar un número infinito de cebadores y su
diseño debe estar regido por tres condiciones
básicas: %C+G alrededor de 50-70%, que no tenga
palíndromes mayores de 6 bases y que no exista
complementariedad en el extremo 3´ (Williams et al.,
1993). Para que ocurra la amplificación, dos secuencias
complementarias al cebador arbitrario deben estar lo
suficientemente adyacentes (~400pb) y en orientación
opuesta que permita la amplificación exponencial por la
ADN-polimerasa (Figura 6).
Figura 6: Detección de un loci
polimórfico a través de la técnica
RAPD.
El ejemplo muestra esquemáticamente los
cromosomas B6 y C3H (líneas horizontales). A: Los
recuadros sobre las líneas representan fragmentos
genómicos (loci RAPD) que pueden ser amplificados
con un primer en particular. El locus B es
polimórfico. B: Ilustración del patron de bandeo que sera
obtenido de la electroforesis de los productos de B6 y
CH3.
Durante la fase de alineamiento de la reacción de
PCR-RAPD, el primer arbitrario se unirá a los sitios de la
secuencia complementaria en el ADN molde desnaturalizado. Si dos
moléculas se alinean con el molde en cadenas opuestas, con
la orientación apropiada y con una distancia amplificable
(menor o igual a 2500 bases) entonces será amplificado un
fragmento discreto de ADN. Cada primer es potencialmente capaz de
amplificar un número de fragmentos (1-10 o más) de
diferentes loci durante la misma reacción de PCR
resultando en varias bandas en el gel. Los segmentos amplificados
pueden ser visualizados en un gel de agarosa teñido con
bromuro de etidio o en geles de poliacrilamida de alta
resolución visualizados por autorradiografía o
teñidos con plata (Waugh y Powell, 1992)
detectándose el polimorfismo como ausencia o presencia de
bandas de un fragmento particular.
Los polimorfismos RAPD resultan de la diferencia de
secuencias en uno o ambos sitios de unión de los primers,
los cuales evitan el alineamiento de la secuencia molde. Otras
fuentes de
polimorfismo RAPD pueden incluir diferencias de apenas un par de
bases (mutaciones puntuales) que son suficientes para causar
complementariedad del primer en el sitio de iniciación;
delecciones o inserciones adyacentes en el sitio de
iniciación de modo que provoquen la acción de la
ADN-polimerasa, por lo que los marcadores RAPD tienen naturaleza
binaria, el segmento amplificado está presente o no; son
marcadores dominantes porque solo se amplifica una variante
alélica, aquella que cumple con los requisitos de
complementariedad entre el cebador y las cadenas de ADN a una
distancia menor o igual a 2Kb (Cornide et al., 2002).
Dichas mutaciones pueden variar también la talla de la
región entre los sitios o evitar la amplificación.
Algunos autores (Bowditch y et al.., 1993) sugieren que
pueden ocurrir también si se forman estructuras
secundarias alrededor de los sitios de unión de los
primers durante ciclos de alineamiento con temperaturas
relativamente bajas. Estas estructuras secundarias pueden
interferir con el alineamiento de los primers y/o la
extensión por la ADN polimerasa. Las mutaciones en estas
regiones pueden estabilizar o desestabilizar la formación
de estructuras para originar polimorfismos RAPD.
La distribución de marcadores RAPD a lo largo del
genoma es una consideración importante cuando se
evalúa la utilidad de estos marcadores, los cuales
están ampliamente ubicados más o menos al azar por
todo el genoma. Existen reportes que verifican su presencia en el
genoma de numerosas especies, (Cheah et al., 1994;
Postlethwait et al., 1994; Hunt y Page, 1995; Cushwa y
Medrano, 1996; Rincon et al., 2000; Alves et al.,
2003). Los RAPDs se han utilizado también para la
caracterización racial en ganado bovino (Parejo et
al., 2002),
Una característica importante en cualquier
marcador genético es que posean una reproducibilidad
consistente. En este tipo de marcadores factores como calidad y
concentración del ADN molde, presencia de contaminantes
precipitables con etanol, concentración de cloruro de
magnesio, contenido de G+C en los primers y su
concentración y la eficiencia del
termociclador, influyen en la amplificación y afectan la
sensibilidad de la reacción, además de la fuente de
la ADN polimerasa (Cushwa y Medrano, 1996).
Esta técnica se diferencia fundamentalmente de
otras y muestra ventajas, por ejemplo, sobre RFLP (Lynch and
Milligan 1994), en que no se basa en hibridación sino en
la amplificación de ADN, lo que implica simplicidad y
rapidez, lo cual se debe a la posibilidad de detectar
polimorfismo por la visualización directa de las bandas en
el gel, eliminando todas las etapas de transferencia de ADN para
membranas (Southern Blot), hibridación con sondas
específicas y autorradiografía; no requiere del
desarrollo de una librería de sondas específicas,
sino que un conjunto de primers arbitrarios puede utilizarse para
cualquier organismo; se elimina la necesidad de isótopos
radiactivos, se requiere 10-3 veces menos
concentración de ADN que para RFLP y la principal
desventaja es el bajo contenido de información genética por loci
asociado a la dominancia de los marcadores RAPD (Williams et
al., 1990, 1993), además de que para su desarrollo
requiere que se garanticen condiciones de adecuada repetibilidad,
además de ser un método muy trabajoso y
costoso.
Cuando los productos de la amplificación se
separan en electroforesis empleando gradiente desnaturalizante
donde los fragmentos de ADN migran desde una concentración
baja hasta la mayor (80%), entonces se denomina RAPD-DGGE
(denaturing gradient gel electrophoresis). Esta variante se
emplea para la detección del polimorfismo dek ADN en
situaciones donde el polimorfismo de la longitud de los
fragmentos de restricción es bajo, pero se espera
encontrar variaciones en su secuencia (Dweikat y McKenzie,
1997)
2.2.4. Polimorfismo de Conformación de las
Cadenas Simples ("Single Strand Conformations Polymorphism",
SSCPs)
El ADN de cadena simple tiende a doblarse y formar
estructuras complejas estabilizadas por enlaces intramoleculares
débiles, especialmente por puentes de hidrógeno. La mobilidad
electroforética de dichas estructuras sobre geles no
desnaturalizantes dependerá no solo de la longitud de las
cadenas, sino también de su conformación, la cual
esta determinada por la secuencia de ADN.
Consiste en la detección de las diferencias en la
estructura
secundaria o terciaria entre fragmentos de ADN amplificados, con
distinta secuencia (Orita et al., 1989). Esto permite la
detección de mutaciones puntuales de ADN sin necesidad de
conocer su secuencia (Berta et al., 1990) y son capaces de
identificar entre el 30 y 70% de todos los polimorfismos debidos
a una mutación simple (Larsen y Nielsen, 1992). Su
detección se lleva a cabo en un gel de acrilamida en
condiciones no desnaturalizantes. Los primer pueden estar
radiaoctivamente marcados, o puede realizarse la detección
de los productos amplificados por tinción con plata y
siempre deben incluirse muestras controles para identificar el
tipo salvaje del mutado (Figura 7).
Figura 7: Monitoreo de una
mutación por análisis de SSCP. El Exon 3 del
gen CFTR gene se amplificó por PCR partiendo de ADN
genómico de 9 individuos no relacionados entre sí y
se incluyeron 6 muestras controles que contenían la
mutación en dicho exón. El ADN de
conformación simple migra más lentamente en el
mismo gel (panel superior).
SSCP es simple y adecuadamente sensible para fragmentos
de hasta 200pb de longitude, y han sido utilizados en la
identificación de variantes alélicas de las
proteínas lácteas (Barroso et al., 1999a y
b, Prinzenberg et al., 1999; Klauzinska et al.,
2001) así como en estudios de expresión de ellas
(Robitaille y Petitclere, 2000), pero para el desarrollo de esta
metodología se requiere una amplia batería de
oligonucleotidos que encarece su utilización.
2.2.5. Polimorfismo de longitud de los fragmentos
amplificados (Amplified Fragment Length Polymorphism,
AFLP)
Consiste en la amplificación de múltiples
regiones arbitrarias del gnoma (Vos et al., 1995). Se basa
en la amplificación arbitraria de fragmentos de
restricción de ADN ligados a adaptadores: se utilizan
cebadores semiespecíficos con secuencia complementaria al
adaptadpr en el extremo 5´. Involucra cuatro etapas:
digestión con dos enzimas de restricción, una de
corte raro (reconoce secuencias de 6pb) y otra de cirte frecuente
(reconoce secuencias de 4pb); acoplamiento de adaptadores
específicos de doble cadena a los extremos de los
fragmentos de restricción; amplificación selectiva
de fragmentos con cebadores específicos y
separación de los fragmentos por electroforesis en geles
de poliacrilamida (figura 8).
Se pueden utilizar varios métodos para revelar
elpatrón de bandas: empleo de isótopos radiactivos,
fragmentos biotinilaos y la tinción con nitrato de
plata.
Mediante la selección del número de
nucleotidos selectivos es posible controlar el número de
fragmentos a amplificar, en una relación inversamente
proporcional. El polimorfismo es detectado por la presencia o
ausencia de bandas debido a mutaciones en los sitios de
restricción o en secuencias adyacentes a estos, los cuales
se complementan o se diferencian de los nucleotidos selectivos
añadidos a los cebadores de la PCR, y por inserciones o
delecciones dentro del fragmento amplificado (Savelkoul et
al., 1999).
Tiene como ventajas que se obtiene un alto grado de
polimorfismo, un mayor número de marcadores por gel
analizado y no requiere del conocimiento
de la secuencia de ADN. Dedido a la cantidad de marcadores que
pueden ser generados, el mapero genético puede realizarse
con mayor rápidez y más fácilmente. Es una
técnica para estudios de biodiversidad.
Comparado con RFLP es más rápido, menos laborioso y
provee mayor información. Revela fundamentalmente el
polimofismo dominante, que puede ser por la presencia o ausencia
del sitio de restricción o por un simple variación
de un n ucleotido en el genoma (Cornide et al.,
2002).
Los marcadores AFLP pueden ser aislados del gel y usarlo
como sondas para caracterizar nuevos clones, o secuenciarlos para
diseñar cebadores y emplearlos en otras técnicas
basadas en PCR.
Figura 8. Representación
esquemática de AFLP
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