Estudio de los efectos neurotóxicos del veneno de la serpiente micrurus mipartitus (Familia: ELAPIDAE) (página 2)

Partes: 1, 2

Todas las especies de la familia
elapidae son proteroglifas, es decir con un maxilar
superior alargado y en su extremo anterior un colmillo
pequeño, curvo y dirigido hacia atrás perforado
interiormente y comunicado con la glándula productora de
veneno, esta familia posee los
venenos más tóxicos de las serpientes
terrestres.

A. COLMILLOS PROTEOGLIFOS.

B. GLÁNDULA VENENOSA

C. CONDUCTO DE VENENO EN
COLMILLO

Fuente: A, C Seminario
Ofidismo. Estudiantes Veterinaria.
Universidad del
Tolima.

B, Biblioteca de
Consulta Microsoft
® Encarta ® 2005.

Los elapidos están representados en América
por 3 géneros: micrurus, leptomicrurus y
micruroides. Las especies que componen el genero
micrurus (cola corta) en un numero mayor de 50 son las
corales, venenosas o verdaderas llamadas también
coralillas o gargantillas, en Colombia se han
descrito 28 especies diferentes.

La Micrurus mipartitus es una serpiente de una
longitud promedio de 80 cm., pero puede alcanzar un poco mas de
un metro. El ojo es pequeño, puntiforme y la pupila
vertical semieliptica. Tiene anillos negros separados por blancos
o amarillos mas delgados, pero el segundo de la cabeza y los tres
o cinco últimos, son rojos brillantes. Posee 15 hileras de
escamas dorsales y carece de escama loreal en general son de vida
nocturna y subterránea se alimentan de caecilidos,
lagartos y otras serpientes. Son ovíparas, se hallan
distribuidas en centro América y norte de
Suramérica, en Colombia es probablemente las mas abundante
en la cordillera de los andes encontrándose ampliamente
distribuida a un altura aproximada de 1800 metros sobre el nivel
del mar, es común en zonas productoras de café.
[2]

Por su alto poder toxico y
por la distribución geográfica en la zona
que habita el mayor porcentaje de la población colombiana, es quizás, la
más importante de nuestras corales venenosas, el veneno
tiene una acción
neurotóxica con manifestaciones paralíticas del
tipo flácido, la cantidad promedio del veneno producido es
de 2,4-6,7 mg. El 2,09% de la población Colombiana se ha
visto afectada en accidentes con
Micrurus.

4. VENENO NEUROTÓXICO DE LA M.
mipartitus

La neurotoxicidad es un término que hace
referencia a aquellas alteraciones funcionales, estructurales y
bioquímicas producidas en el Sistema Nervioso
(SN) y que conllevan a la manifestación de diferentes
clases de efectos adversos como consecuencia de una exposición
a un producto
químico. Un efecto adverso implica un cambio que
produce una desregulación o alteración del SN. La
naturaleza de
dicho cambio puede ser neuroquímica, morfológica, o
relacionada con la conducta y puede
manifestarse transitoria o permanentemente. [9]

No todas las neurotoxinas tienen el mismo sitio ni modo
de acción o producen similares efectos clínicos.
Las neurotoxinas presentes en los venenos de serpientes
actúan sobre distintas estructuras, y
de allí que originan distintos cuadros clínicos y
patológicos.

Se conoce que los componentes principales del veneno de
la M. mipartitus contiene abundantes alpha y
beta-neurotoxinas pre-sinápticas de bajo peso molecular, y
con enzimas
prácticamente ausentes, llamadas dendrotoxinas,
polipéptidos básicos de cadena simple con 57-60
residuos de aminoácidos, unidos por 3 puentes
bisulfuro,que impiden la conducción de los impulsos
nerviosos por bloqueo de canales de potasio en la membrana del
axón terminal, causando una sobreliberación de
acetilcolina, produciendo estimulación inicial y luego
bloqueo, generando una parálisis fláccida.[10] . La
dosis letal media (DL50) del veneno de la serpiente M.
mipartitus aplicadas a un ratón es de 9
µg.

5. MECANISMO DE
ACCIÓN DE LAS NEUROTOXINAS

De acuerdo al sitio de acción las neurotoxinas
pueden ser pre o post sinápticas.

Las Neurotoxinas presinápticas de la
unión neuromuscular, afectan el axón Terminal,
produciendo ruptura de vesículas sinápticas, con
una sobreliberación inicial de acetilcolina provocando
así un cese súbito en la descarga de la misma, y
bloqueando completamente la transmisión neuromuscular.
Esto causa parálisis fláccida de los
músculos afectados. Sin embargo, el proceso no es
instantáneo. La neurotoxina presináptica debe
localizar la unión neuromotora, unirse a la membrana del
axon terminal, y dañar esta membrana.

Es improbable la aparición de la parálisis
presináptica en menos de 1-2 horas posteriores a la
mordedura de la serpiente. Normalmente se ve primero los rasgos
clínicos de parálisis temprana en los nervios
craneales, con ptosis (caída de los párpados
superiores) como primera señal. Debido a que las
neurotoxinas presinápticas causan daño al
axon terminal, ellas son pobremente sensibles a la terapia con el
antiveneno. Así, una vez que la parálisis
fláccida severa se establece con envolvimiento
respiratorio, el antiveneno se muestra ineficaz
para invertir la parálisis. [10]

Las neurotoxinas presinápticas se diferencian de
las neurotoxinas postsinápticas ya que estas
últimas actúan sobre la placa neuromotora y son
más comunes que las toxinas presinápticas,
además son menos potentes, pero más rápidas
en actividad, y potencialmente más letales.

Estas neurotoxinas se unen al receptor proteico de
acetilcolina o a sus adyacencias en el extremo terminal de la
placa del lado del músculo, bloqueando así la
señal que llega al músculo, produciendo una
parálisis fláccida. Debido a que ellas pueden
actuar tan pronto como alcanzan la placa neuromotora, pueden
causar parálisis más rápido que las
presinápticas. Como estas toxinas se hallan expuestas en
la superficie celular, en el compartimiento extracelular,
extravascular, ellas son accesibles a los antivenenos.
Así, las parálisis postsinápticas pueden
revertirse con el antiveneno.

6. CUADRO
CLÍNICO DE ENVENENAMIENTO POR M.
MIPARTITUS

Los accidentes elapidicos corresponde al 3% de los
accidentes registrados en Colombia. La causa de muerte por
este tipo de envenenamiento es la insuficiencia respiratoria.
[4]

Fuente: Seminario Ofidismo. Estudiantes Veterinaria.
Universidad del Tolima.

Los síntomas pueden surgir precozmente, en menos
de una hora de la mordida. Se debe vigilar al paciente
mínimo por 24 horas, por si hay retardo en la
aparición de los signos y
síntomas.

MANIFESTACIONES LOCALES: hay dolor discreto,
generalmente acompañado de parestesias con tendencia a
progresión próxima.

MANIFESTACIONES SISTEMICAS: inicialmente pueden
presentar vomito; Posteriormente puede surgir un cuadro de
flacidez muscular progresiva (fig. C), llegando a ptosis
palpebral (fig. A), oftalmoplejia (fig. B) y una presencia de
facies mialgicas por las "neurotoxinas". Asociado a lo anterior
puede haber dificultades para mantener la posición erecta,
mialgia localizada o generalizada y dificultad para deglutir por
la parálisis del velo del palatino. La parálisis
muscular puede progresar y afectar los músculos
respiratorios que llevan a disnea y en el peor de los casos
paro
respiratorio. [12]

CLASIFICACIÓN: la parálisis
fláccida de los músculos respiratorios comprometen
la ventilación, pudiendo evolucionar a parálisis
respiratoria.

Estos casos deben ser considerados como potencialmente
graves por el riesgo de
insuficiencia respiratoria.

A. Ptosis palpebral

B. Oftalmoplejia

C. Flacidez muscular

Fuente: fig. A. B. C. Seminario Ofidismo. Estudiantes
Veterinaria. Universidad del Tolima.

7. IMPORTANCIA
DE LA RATA COMO MODELO
EXPERIMENTAL EN ESTUDIOS NEUROTÓXICOS.

La experimentación animal se define como una
actividad que tiene como misión
evidenciar y aclarar fenómenos biológicos sobre
especies animales
determinadas, el animal de experimentación es una de las
piezas fundamentales en la biomedicina, tanto en los proyectos de
investigación como en la pruebas
diagnosticas y en los controles de los productos
farmacológicos.

En la significación de la experimentación
animal existen dos ideas básicas.

La primera es que la interpretación de los resultados y la
extrapolación de estos de una especie a otra dependen del
modelo experimental utilizado; esta es la noción de
competencia o
actuación, es decir, de qué fenómeno se
trato y como lo podemos explicar. La segunda idea es que no
existe un modelo perfectamente extrapolable al hombre, pero
puede haber una afinidad de modelos
experimentales, cuyas respuestas, fragmentarias, al converger,
incrementen la significación biológica del
fenómeno observado. En este sentido, el modelo animal
experimental debe reproducir un efecto proveniente del sujeto
original, poseer una estructura,
una lógica
propia y realizara actos determinados.

La rata tiene aproximadamente cien años de haber
sido domesticada, lo cual es relativamente poco tiempo si la
comparamos con otras especies animales. La domesticación
es una forma de evolución. En el caso de la rata de
laboratorio,
los cambios ocurren en el tamaño y el color así
como en su comportamiento, por ejemplo en la
disminución de la agresividad.

A diferencia de lo que sucede en la vida silvestre,
donde los individuos más agresivos y territoriales son los
que copulan con las hembras, en la rata de laboratorio se busca
seleccionar a los individuos menos agresivos para su reproducción, aun así, conserva
cierta agresividad que puede variar de una cepa a otra. Otros
instintos se mantienen prácticamente
inalterados.

7.1. RATA Rattus norvegicus.
CEPA WISTAR

Para efecto de estudios en el sistema nervioso,
el modelo animal que se ajusta mejor a la experimentación
es la rata de la cepa WISTAR, Rattus norvegicus
criada en el laboratorio, gracias a sus características
biológicas tales como el tamaño de los individuos y
su reproducción constante a lo largo de todo el
año; esto último redunda en el abasto, así
como en la reducción del número de individuos
usados en investigación y de las variables en
los resultados obtenidos, además la rata reacciona
fácilmente ante cosas o situaciones nuevas y su docilidad
permite una fácil manipulación. Por otra parte, el
bienestar que le proporciona las condiciones sanitarias de un
laboratorio tiene como consecuencia la reducción del
desasosiego (estrés)
diminuyendo así los errores en los resultados de la
investigación.

La cepa WISTAR es original del Instituto Wistar en el
Reino Unido en 1947. Luego adquirida por laboratorio Charles
River (CRL). Esta colonia particular se seleccionó debido
a una incidencia baja de hidronefrosis, que es el resultado de la
obstrucción del flujo de orina en la vía excretora,
causada casi siempre por anomalías congénitas de
los uréteres o de una hipertrofia
prostática.

Orden: Rodentia

Familia: Muridae

Nombre científico: Rattus
norvegicus (Berkenhout)

Nombre Común: Rata de
Alcantarillas

La nomenclatura
Crl: (WI).

Morfología Adultos:

Longitud: entre 35 y 45 cm.
Longitud de la cabeza y cuerpo: 186-240
mm.
Longitud de la cola: 122-215 mm.
Longitud del pie: 30-45 mm.
Longitud de la oreja 15-20 mm.
Peso: 195-485 g.
Apariencia general: larga y
robusta.
Tamaño adulto (peso g): 200–500
g.
Nariz: chata.
Orejas: Las orejas son cortas y ligeramente
peludas.
Ojos: pequeños.
Cola: obscura arriba, pálida por
debajo.
Piel: café mezclado con negro, vientre
gris a amarillo, blanco peludo.
Excremento: en forma de cápsula, de 2
cm x 1 cm.

De color blanco el albino. El pelaje es largo y
áspero. El hocico es embotado, con vibrisas cortas y
gruesas. La cola es más corta que la longitud del cuerpo y
la cabeza, es robusta, moderadamente bicolor y es tenuemente
cubierta con pelos ásperos. Las patas son largas y
gruesas; la parte superior de ellas es blancuzca.

La hembra tiene 5-6 pares de mamas ubicadas a lo largo
de la parte ventral del cuerpo. La posición de las
crías al momento de nacer es de cabeza.

No presentan vesícula biliar, el pulmón
derecho presenta cuatro lóbulos, mientras

que el izquierdo sólo uno. Esta especie puede
alcanzar gran tamaño algunos ejemplares llegan a 1/2 kg.
de peso.

Órganos de los Sentidos:
Los roedores hacen uso especial de sus sentidos para moverse en
busca de alimento y escapar del peligro, lo cual es importante
para la reacción a estímulos aplicados en la
investigación.

Visión: Este sentido es el menos
desarrollado e importante en la vida de la rata, tiene una
pobre agudeza visual entre 1 a 1.5 m. Y no distinguen los
colores.
Oído: El sentido del oído es
agudo: pueden oír dentro del aspecto de ultrasonido a 50
Khz. o más (los humanos oyen en el rango de 20 Khz.).
Entre ellos emiten unos sonidos para avisarse de los posibles
peligros.
Olfato: El olor es un sentido importante en
los roedores comensales. Las ratas marcan objetivos
con la orina para reconocer su colonia. Los roedores comensales
no presentan aversión al olor del hombre.
Gusto: Excelente.
Tacto: Excelente.

Características Reproductivas:

Período de gestación: 3
semanas.
Número de Camadas al Año: 3 –
6.
Período desde el nacimiento hasta la madurez
sexual: 12 semanas.
Potencial de reproducción a partir de una
pareja por año: 200 individuos.

La edad para empezar a aparearse está entre los 2
y 3 meses. Las camadas nacen alrededor de 22 días
después del apareamiento (periodo de gestación),
una rata hembra puede producir 10-12 camadas por año.
Adquiere la madurez sexual de los 3 a los 5 meses, el
período de gestación es de 22 días
prolongándose cuando se presentan la lactancia y la
gestación al mismo tiempo, en promedio tiene de 6 a 12
crías por parto y aunada
a su alta fecundidad es capaz de criar de 6 a 10 camadas por
año. La proporción de hembras y machos por camada
es de 4:4 y la ganancia de peso corporal desde el nacimiento
hasta el deteste es de 1.31 gramos/ día y desde el deteste
hasta la sexta semana es de 4.3 gramos/día. La lactancia y
la gestación pueden ocurrir simultáneamente ya que
la hembra puede ovillar poco tiempo después del parto (48
hrs.) Su promedio de vida es de un año.

Alimentación:

? Preferencias alimenticias: Son
omnívoros y tienen preferencia por lo fresco (22- 30 g /
día). Su alimentación la
constituye carne reseca, vegetales, cereales y
frutas.

? Requerimientos de líquidos: 15-30
ml/día.

Etología: Son desconfiados. Reaccionan
fácilmente ante cosas o situaciones nuevas. Tienen mucha
agilidad para escalar y nadar.

La actividad es generalmente nocturna, ya que las ratas
se orientan bien en la oscuridad. La rata común suele
seguir rutas previamente exploradas y aprendidas. Si las
condiciones les son favorables, es decir, si disponen de
refugios, alimentos y
humedad suficiente, estos roedores se reproducen
rápidamente

8.
TECNOLOGÍAS PARA EL ESTUDIO NEUROLÓGICO EN
MODELOS EXPERIMENTALES.

Órganos cuya función
esta estrechamente vinculada con el sistema nervioso, como la
vista o el oído, pueden también padecer
alteraciones que ponen de manifiesto afecciones
neurológicas. Desde ese punto de vista, los estudios
neurofisiológicos están destinados a estudiar la
función de estos órganos o las vías de
conducción, que pueden poner de manifiesto la existencia
de procesos,
afecciones neurológicas o alteraciones de la
función sensorial o motora.

Los procedimientos
que más se utilizan en la práctica son:

*Micro electroencefalografía: El procedimiento se
lleva a cabo colocando sobre el cráneo 20 microelectrodos,
que se adhieren Los microelectrodos están conectados con
un amplificador, que envía señales
cerebrales captadas por esos microelectrodos y que se registran
en la pantalla de una computadora.
El estudio dura aproximadamente 20 minutos y es muy importante
que el individuo se
halle con las más bajas condiciones de estrés
posibles durante el procedimiento.

* Microelectromiografía: La
microelectromiografía es una técnica que utiliza
electrodos para investigar en forma directa la actividad
eléctrica del músculo. Se realiza por medio de un
microelectrodo de aguja concéntrica que se inserta en el
músculo. A través de un amplificador, se pueden
registrar los llamados potenciales de unidad motora durante la
activación voluntaria. Se conoce con el nombre de
potencial de unidad motora a la señal eléctrica
generada por las fibras musculares inervadas por un mismo
axón. El análisis de la duración y amplitud
de un número de potenciales de unidad motora del
músculo. Permite determinar si la debilidad muscular de un
paciente depende de un trastorno primario del músculo o de
una alteración neurogénica. En este último
caso la lesión puede originarse en la motoneurona espinal,
en los plexos o en los nervios periféricos. Para localizar el trastorno y
determinarlo con precisión, resulta fundamental
complementar el electromiograma con un estudio de velocidad de
conducción de los nervios periféricos.

Además, la inserción del microelectrodo en
el músculo se lleva a cabo para estudiar la actividad
eléctrica durante el reposo muscular. En el músculo
que ha perdido su inervación pueden observarse los
llamados potenciales de denervación, cuyos elementos mas
notables son las fibrilaciones y ondas agudas
positivas.

* Velocidad de conducción de los nervios
periféricos: La velocidad de conducción es un
complemento capital de la
microelectromiografía, pudiendo localizar la lesión
en alguna de las estructuras que van desde la motoneurona
espinal, hasta la unión neuromuscular. Es un estudio
fundamental para diagnosticar atrapamientos de nervios
periféricos o para diagnosticar, además
polineuropatías periféricas. Por medio del mismo se
puede determinar si la polineuropatía es motora, sensitiva
o mixta, y si está afectada la vaina de mielina, el
axón o ambas estructuras.

Permiten el análisis computarizado de las
señales, el cálculo
automático de la velocidad de conducción, y la
comparación inmediata del valor obtenido
con valores
normales.
*Estimulación Magnética Transcortical
(PEM):

Este método
permite estudiar las vías motoras descendentes del
cerebro hacia
los músculos periféricos

La Estimulación Magnética Transcortical
permite excitar en forma transcraneana y relativamente indolora
la corteza motora y, a través de la misma, generar
impulsos descendentes hacia los músculos de los miembros.
Esto permite hacer un estudio de la velocidad de
conducción de las fibras motoras (haz piramidal) y por lo
tanto tener acceso a la evaluación
funcional de esas fibras.

* Ensayo de
Citotoxicidad mediante la técnica del
WST-1.

La técnica de citotoxicidad mediante el reactivo
WST-1 (sales de tetrazolium/ formazan) permite medir de una forma
directa la viabilidad celular frente a diferentes
estímulos químicos (citotoxicidad), y de una manera
indirecta, medir la proliferación celular.

Se trata de un ensayo
colorimétrico, no radiactivo, de cuantificación
espectrofotométrica que se basa en la degradación
de las sales de tetrazolium (WST-1) a sales de formazan, mediante
la acción de las deshidrogenadas mitocondriales, que se
producen de forma natural cuando las células
son viables. Esta técnica es sensible, rápida y
sencilla.

En una cabina de flujo laminar y en condiciones de
esterilidad (puntas amarillas

estériles), se aplica la molécula problema
en los pocillos correspondientes de la placa del experimento de
citotoxicidad. Se homogeniza el medio celular de la placa con
movimientos rotatorios suaves a fin de que se pueda obtener una
mezcla regular de la molécula en el medio de
cultivo. Se incuba en la estufa de cultivos celulares (5% CO2,
95% aire, 90%
humedad, 37°C) durante 30 minutos.

Luego de ello, se aplica el reactivo WST-1 en cada uno
de los pocillos de la placa del experimento de citotoxicidad
celular. Se homogeniza el medio celular a fin de mezclar el
reactivo WST-1 en el medio de cultivo. Se vuelve a incubar
durante 3:30 horas. La lectura de
la placa se realiza mediante un lector epectrofotométrico
con filtro de 450 nm y así se registra los resultados de
lectura
obtenidos.

9.
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