Diseño de la planta física de un laboratorio de cultivo celular y quirófano para biotecnología aplicada

2. Laboratorio de
   Biotecnología aplicada
3. El laboratorio de cultivo
   celular.
4. Quirófano
5. Manual de seguridad para
   operaciones en laboratorios de biotecnología y de tipo
   biológico
6. Aplicaciones
   de la biotecnología en la actualidad
7. Conclusiones
8. Referencias

INTRODUCCIÓN

La ciencia ha
estado
evolucionando a una velocidad tan
increíble que los avances
tecnológicos deben satisfacer las necesidades que
aparecen al transcurrir de los años. Por ello es tan
importante dar a conocer estos supuestos teóricos para que
puedan ser tomados como apoyo en la elaboración de un
laboratorio que va a estar a la altura de los requerimientos
establecidos por las leyes y para la
aplicación de muchos proyectos de
biotecnología para el desarrollo del
conocimiento
científico.

Para dicha construcción se tuvo en cuenta muchos
factores que deben estar presentes a la hora de desarrollar
cualquier trabajo de
investigación, en este caso equipos,
mediciones y obligaciones
que debe tener un laboratorio de cultivo celular con su
respectivo quirófano, además de las normas de
bioseguridad que se deben tener en cuenta, para asegurar el
desempeño de científicos y del
trabajo que se esta realizando.

Palabras clave: laboratorio biotecnología,
quirófano, cultivo celular, bioseguridad

1. LABORATORIO DE
BIOTECNOLOGÍA

Como cualquier lugar de trabajo, los laboratorios de
biotecnología y de tipo biológico han de reunir
unas condiciones, que si bien pueden variar notablemente en
función
de su finalidad (un laboratorio dedicado a la obtención de
antígenos monoclonales difiere de uno
destinado a la mejora genética
de vegetales y éste, a su vez, es muy distinto de otro en
el que se realizan investigaciones
microbiológicas), todos ellos deben estar acordes con lo
dispuesto en el Real Decreto 486/1997, de 14 de abril,
sobre disposiciones mínimas de seguridad y
salud en los
lugares de trabajo.

Para definir las distintas condiciones ambientales que
los laboratorios de biotecnología y de tipo
biológico deben reunir conforme a lo establecido en
las disposiciones legales vigentes, se han tenido en cuenta las
actividades que se realizan en dichas dependencias de la UPV,
sobre la base documental de las actuaciones llevadas a cabo por
el Servicio de
Prevención de Riesgos
Laborales de la UPV, con el apoyo de las visitas realizadas a las
diferentes instalaciones. A este respecto, se pueden considerar
las siguientes actividades laborales:

• Tareas docentes y
  de administración
• Trabajos de investigación propiamente dichos,
  incluyendo las operaciones
  preparatorias previas, mantenimiento de equipos, etc.

Seguidamente, pasamos a describir algunos de los
aspectos a tener en cuenta en lo concerniente a orden y limpieza,
espacios de trabajo, ventilación, iluminación, etc., resaltando los matices
más relevantes.

1.2 Espacios de trabajo por trabajador

Para que puedan darse unas buenas condiciones de orden y
limpieza es necesario también respetar las dimensiones
mínimas de los espacios de trabajo, permitiendo a
trabajadores realizar sus actividades sin riesgos para su
seguridad y salud y en condiciones ergonómicas aceptables.
Las dimensiones mínimas que deben reunir tales espacios
son las siguientes:

• Altura desde el suelo hasta el
  techo: 3 metros.
• Superficie libre por trabajador: 2 metros
  cuadrados.
• Volumen (cubicaje) no ocupado por el trabajador: 10
  metros cúbicos.

La separación entre los elementos materiales
existentes en el laboratorio deberá ser suficiente para
que los trabajadores puedan realizar su labor en condiciones de
seguridad, salud y bienestar.

Cuando el espacio libre de que se disponga en el
laboratorio no permita a los trabajadores la libertad de
movimientos requerida para el desarrollo de su actividad,
deberá disponerse de un espacio adicional suficiente en
las inmediaciones del puesto de trabajo.

1.3 Temperatura,
humedad y ventilación

La exposición
de los trabajadores a las condiciones ambientales de los
laboratorios en general no debe suponer un riesgo para su
seguridad y salud, ni debe ser una fuente de incomodidad o
molestia. Deben evitarse:

• Humedad y temperaturas extremas.
• Cambios bruscos de temperatura.
• Corrientes de aire
  molestas.
• Olores desagradables.

El aislamiento térmico de los locales donde se
hallan ubicados los laboratorios debe adecuarse a las
condiciones climáticas propias del lugar.

A modo de resumen, la tabla I muestra las
condiciones de temperatura, humedad y ventilación que, de
conformidad con lo establecido en la legislación vigente
(anexo III del Real Decreto 486/1997, de 14 de abril) deben
reunir los laboratorios de biotecnología y de tipo
biológico en los que se desarrollan las diferentes
actividades que se indicaron en el apartado 1 del presente
manual.

Tabla I. Límites de
temperatura, humedad y ventilación, según lo
establecido en el anexo III del R. D. 486/1997.

Mención especial merece el trabajo con
cámaras de climatización y frigoríficas.
Aunque, por las características propias del trabajo no sea
habitual que los trabajadores permanezcan en su interior durante
espacios de tiempo
prolongados, es preciso tener en cuenta las siguientes
precauciones:

• Considerando las diferencias de temperatura con el
  exterior, las personas que deban acceder al interior de dichas
  cámaras irán provistas de ropa adecuada,
  especialmente en aquellas cuya temperatura es inferior a 0
  ºC.
• Las puertas de las cámaras de
  climatización deben disponer de un sistema de
  cierre que facilite la apertura desde su interior. En
  ningún caso deberán disponer de cerradura con
  llave.
• Es conveniente que en el exterior de dichas
  cámaras exista una señal luminosa que advierta de
  la presencia de personas en su interior.

Con independencia
de las condiciones de aireación del local, siempre que sea
necesario manipular productos que
puedan originar emanaciones de sustancias peligrosas u olores
desagradables, el trabajo en cuestión se llevará a
cabo bajo campana extractora, que deberá ir provista de
filtros adecuados y estar sujeta a un programa de
mantenimiento
preventivo acorde a sus características.

1.4 Iluminación

La iluminación de los laboratorios debe
adaptarse a las características de la actividad que se
realiza en ellos, siendo de aplicación lo dispuesto en el
anexo IV del antes mencionado Real Decreto 486/1997, teniendo en
cuenta:

• Los riesgos para la seguridad y salud de los
  trabajadores, dependientes de las condiciones de
  visibilidad.
• Las exigencias visuales de las tareas
  desarrolladas.

Los distintos tipos de iluminación se
utilizarán según las circunstancias, es
decir:

• Siempre que sea posible, los laboratorios deben tener
  preferentemente iluminación natural.
• La iluminación artificial debe complementar la
  natural.
• La iluminación localizada se utilizará
  en zonas concretas que requieran niveles elevados de
  iluminación.

Conviene señalar que los requerimientos
mínimos de iluminación en estos locales, recogidos
en el citado anexo IV del Real Decreto 486/1997, son los
siguientes:

Tabla II. Condiciones mínimas
de iluminación, según lo establecido en el anexo IV
del R. D. 486/1997.

Estos niveles mínimos deben
duplicarse cuando:

• Existan riesgos apreciables de caídas, choques
  u otros accidentes
  en los locales de uso general y en las vías de
  circulación.
• Ante la posibilidad de errores de apreciación
  visual, se generen peligros para el trabajador que ejecuta las
  tareas o para terceros.
• Sea muy débil el contraste de luminancias o de
  color entre el
  objeto a visualizar y el fondo sobre el que se
  encuentra.

La distribución de los niveles de
iluminación debe ser uniforme, evitando variaciones
bruscas de luminancia dentro de la zona de trabajo y entre
ésta y sus alrededores. Asimismo, hay que evitar los
deslumbramientos:

• Directos: producidos por la luz solar o por
  fuentes de
  luz artificial de alta luminancia.
• Indirectos: originados por superficies
  reflectantes situadas en la zona de operación o sus
  proximidades.

No utilizar fuentes de luz que perjudiquen la
percepción de los contrastes, profundidad o
distancia entre objetos dentro de la zona de trabajo.

Instalar alumbrado de emergencia de
evacuación y de seguridad en los lugares en los que un
fallo del alumbrado normal suponga riesgo para la seguridad de
los trabajadores. Por último, los sistemas de
iluminación utilizados no deben originar riesgos
eléctricos, de incendio o de explosión.

1.5 Señalización

En los laboratorios de biotecnología y de tipo
biológico, la señalización contribuye a
indicar aquellos riesgos que por su naturaleza y
características no han podido ser eliminados. Considerando
los riesgos más frecuentes en estos lugares de trabajo,
las señales
a tener en cuenta son:

1.5.1 Señales de advertencia de un
peligro

Tienen forma triangular y el pictograma negro sobre
fondo amarillo. Las que con mayor frecuencia se utilizan
son:

1.5.2 Señales de
prohibición

De forma redonda con pictograma negro sobre fondo
blanco. Presentan el borde del contorno y una banda transversal
descendente de izquierda a derecha de color rojo, formando
ésta con la horizontal un ángulo de
45º.

1.5.3 Señales de
obligación

Son también de forma redonda. Presentan el
pictograma blanco sobre fondo azul. Atendiendo al tipo de riesgo
que tratan de proteger, cabe señalar como más
frecuentes en estos lugares de trabajo, las
siguientes:

1.5.4 Señales relativas a los equipos de
lucha contra incendios

Son de forma rectangular o cuadrada. Presentan el
pictograma blanco sobre fondo rojo. Las más frecuentes en
los laboratorios son las que indican el emplazamiento de
extintores y de mangueras para incendios, es
decir:

1.5.5 Otras señales

En función de las características del
local y teniendo en cuenta sus riesgos específicos, los
laboratorios de biotecnología y de tipo
biológico deben exhibir aquellas señales que
avisen de la existencia de tales riesgos.

Conviene recordar también la obligatoriedad de
señalizar las salidas de emergencia y elementos de
primeros
auxilios (botiquín, duchas de emergencia, lavaojos,
etc.).

    Por último, otra
señalización no menos importante es aquella que
permite identificar las tuberías por el color con que
están pintadas, en función del fluido por ellas
transportado, a saber:

En el proyecto se han
previsto 3 áreas de circulación:
1.-Libre
2.-Restringida
3.-Transferencias
La Circulación Libre, por
un pasillo periférico, permite a los visitantes ver el
equipamiento y los procedimientos
del laboratorio a través de ventanas que comunican con las
salas , sin necesidad de ingresar al área aséptica.
Asimismo este pasillo periférico de circulación
libre permite el ingreso de los abastecimientos y la salida de
los elementos utilizados para los procedimientos.

Entre la circulación libre y la restringida hay
Areas de Transferencia para personal y
elementos. Toda la Unidad esta abastecida con aire filtrado, a
presión
positiva y a temperatura y humedad regulables. Se han empleado
para revestimiento de pisos y paredes materiales lisos, lavables
y resistentes para asegurar la higiene y
antisepsia.
El Area de
Circulación Restringida en la que se encuentran las salas
de cultivo de tejidos, la Sala
de Cirugía, el bioterio, la oficina de
registro de
los procedimientos, forman una Unidad Funcional en la que rige la
estricta disciplina de
una Sala de Operaciones.
Se han tenido en cuenta para su realización detalles
minuciosos de construcción tanto en los materiales
empleados como en el diseño
de los ambientes.
Todos los detalles mencionados anteriormente, aseguran que
ningún elemento potencialmente contaminado va a circular
por el área restringida, pues todo aquello que toma
contacto con el paciente se coloca en bolsas que se depositan en
el mueble transferencia para ser retirado y por lo tanto no
regresa al área limpia.
La Sala de Cirugía
reúne iguales características que las mencionandas
en lo referente a revestimientos de piso y paredes y aire
acondicionado.

2.
Laboratorio de cultivo celular

La característica principal que define al
laboratorio de cultivo celular es el mantenimiento de la asepsia.
La tasa de crecimiento de las células en
cultivo es muy inferior al de los contaminantes habituales :
hongos,
levaduras, bacterias y
micoplasmas, y por ello para el mantenimiento del cultivo
será vital evitar la aparición en éste de
cualquier microorganismo
indeseado.

El área de trabajo para realizar cultivos debe
instalarse en una parte del laboratorio tranquila, alejada de las
vias de paso y a ser posible dedicada exclusivamente al cultivo
de células. La solución ideal es diponer de una
habitación aislada.

Las aparición de cabinas de flujo laminar redujo
las necesidades de aislamiento del área de trabajo pero
aún así es recomendable mantener un gradiente de
esterilidad, desde el medio exterior o laboratorio general al
interior de las cabinas de flujo donde se manipularán los
cultivos y del incubador donde se mantendrán.

1. Tipos de laboratorio de cultivo
celular.

Las necesidades de asepsia dependen del tipo de material
que se va a procesar en el laboratorio. Esto define dos tipos de
contención y de área de trabajo diferentes
:

1. el laboratorio de cultivo de tejidos general, para la
manipulación de cultivos no patógenos se
instalará preferentemente en una sala aislada y a la cual
se le suministrará aire filtrado (normalmente mediante un
equipo de filtración y regulador de la temperatura). Esto
produce un aumento de presión atmosférica en el
interior del laboratorio (típicamente entre 15 y 20 mm de
Hg) que impide la entrada de aire no filtrado al área
limpia.

2. el laboratorio de cultivo con patógenos supone
un nivel de contención superior. A fin de evitar la salida
accidental de éstos agentes se filtra el aire que sale de
la sala, generando un déficit de presión en el
interior de ésta. El aire sale siempre
estéril.

2. La instrumentación del laboratorio de cultivo
celular.

En el laboratorio de cultivo celular propiamente dicho
se encuentran los siguientes tipos de instrumentos :

1.
cabinas de flujo laminar (áreas de
trabajo y de contención estéril).

2.
incubadores : baños
termostatizados,
incubadores de CO2,
Incubadores 'roller', …

3.
instrumentos ópticos de observación del
cultivo : microscopio
invertido de contraste de fases,
de fluorescencia,…

4.
instalación de criogenia (tanques
de N2 líquido) y congeladores

5.
equipo de esterilización :

autoclave, equipos de
filtración,…

6.
otros instrumentos :
centrífugas,
contadores electrónicos (Cell
Counters),
equipo de purificación de agua,
balanzas, pH-metro,
pipeteadores…

2.1 Las Cabinas de Flujo Laminar.

Su función es la de mantener un área libre
de partículas, especialmente de posibles contaminantes
(bacterias, levaduras,…) que puedan acceder al cultivo. Esto se
consigue mediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso
del aire a través de un filtro de gran superficie (filtro
HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o en la pared
frontal (flujo horizontal) y que con una eficiencia del
99.999 % retiene las partículas por debajo de un cierto
calibre que es en general de 0.2 um. En la Figura 2.1 se
representa una sección de filtro HEPA. El flujo del aire
es laminar, sin turbulencias en las que puedan quedar retenidas
partículas contaminantes. El flujo laminar se asegura
tanto por la gran superficie del filtro HEPA como por la
velocidad constante del aire, como por la ausencia de fuentes
intensas de calor
(mecheros bunsen) en el interior de las cabinas, generadores de
intensas corrientes de convección.

Tal como ya se ha indicado, las cabinas de flujo laminar
pueden ser de dos tipos : flujo vertical y flujo horizontal,
dependiendo de la posición del filtro HEPA y por ello de
la dirección del flujo laminar (ver figura
2.2).

Los diferentes tipos de cabinas de flujo laminar se
diseñan con diferentes propósitos :

a. Protección personal : protección del
personal de los posibles agentes dañinos del interior de
la cabina.

b. Protección del producto,
experimento o cultivo que se encuentra en el interior de la
cabina de los contaminantes exteriores o de la
contaminación cruzada con otros productos o cultivos
situados en la misma cabina.

c. Protección medioambiental : evitar la salida
al medio ambiente
de productos o agentes contaminantes.

Dependiendo de la importancia que se le conceda a cada
uno de estos factores en el diseño de la cabina se trata
de cabinas de clase I, II o
III.

2.2 Incubadores.

Se trata de equipos comunes a la mayor parte de los
laboratorios de biología (estufas,
baños termostatizados,…) con la excepción del
incubador de CO2, y del incubador con "roller".

Las células en cultivo son capaces de soportar
sin daños importantes variaciones de temperatura, siempre
que sean por debajo de la temperatura corporal del animal del que
proceden. Así pues las células humanas soportan
incubaciones a 4 ºC durante dias y pueden ser congeladas a
-196 ºC durante años (con sustancias preservantes).
Sin embargo no sobreviven más de unas pocas horas a
variaciones de 2 ºC por encima de 37ºC. Las
células procedentes de animales
poiquilotermos soportan mejor un amplio rango de temperaturas de
incubación.

Las células de homeotermo suelen crecer bien
entre 33 y 37 ºC, pero en ese margen presentan importantes
variaciones en su tasa de crecimiento. En un incubador de
células es por tanto más importante la consistencia
de la temperatura (invariabilidad durante prolongados periodos de
tiempo, con oscilaciones inferiores a 0.5 ºC) que su
precisión a fin de mantener a las células en
condiciones en las que las tasas de crecimiento sean constantes.
Por ello se deben usar incubadores con movimiento de
aire forzado en el interior, y colocar los contenedores de
células sobre estanterias agujereadas y nunca sobre el
fondo o las paredes del incubador.

Las necesidades de asepsia en el incubador son
considerablemente menores que en el área de trabajo
(cabina de flujo laminar) pero sin embargo es muy recomendable
mantener una estricta limpieza, desinfección
periódica del incubador, y especialmente no introducir, o
eliminarlos inmediatamente, cultivos contaminados en el
incubador.

Para determinar el número y tipo de los
incubadores requeridos se tendrá en cuenta :

– el tipo de cultivos a realizar : primarios o de
líneas celulares estables. Es conveniente no cultivar en
el mismo incubador cultivos primarios con líneas celulares
estables, pues los primeros son una importante fuente de contaminación.

– la especie y el tipo de células a cultivar. Es
importante la determinación exacta de la temperatura de
incubación para la que se tendrá en cuenta la
temperatura corporal del animal del que proceden las
células, así como cualquier variación
regional de temperatura (la piel suele tener una temperatura
inferior). Algunos autores sugieren incorporar asimismo un factor
de seguridad a la temperatura de incubación. Por ejemplo
para la incubación de células humanas sugieren el
cultivo a 36.5 ºC, cercano al valor de la
temperatura corporal pero un poco inferior para mayor seguridad.
Esto es en la actualidad innecesario en los incubadores modernos,
capaces de regular la temperatura de incubación con gran
precisión. Así pues serán necesarios tantos
incubadores como diferentes temperaturas de incubación se
precisen.

2.2.1 Incubador de CO2

El mantenimiento de la temperatura en una atmósfera con una
tensión controlada de CO2 y adicionalmente de humedad
elevada es el objetivo del
incubador de CO2.

Las condiciones del cultivo : temperatura, humedad
atmosférica y niveles de CO2 son característicos de
cada línea celular. El nivel de CO2 se establece para
mantener el equilibrio
carbonato-bicarbonato en el medio de cultivo, habitualmente al
5%.

Puedes encontrar información de actualidad en los sitios
web de las
empresas que
fabrican estos incubadores : Forma,
Revco, Jouan,
…

2.2.2 Incubador "roller".

2.3 Instrumentos ópticos de observación :microscopio de contraste de
fases invertido.

2.4 Congeladores e instalación de criogenia
(depósito de N2 líquido)

Es recomendable que los congeladores y la
instalación de criogenia estén en recintos
separados a la unidad de cultivo propiamente dicha pues los
ventiladores y compresores son
una fuente importante de turbulencias y suciedad en el
laboratorio.

Es preciso el almacenamiento de
soluciones y
células a diferentes temperaturas, para lo que se requiere
:

1. neveras (4 ºC) para el almacenamiento de
medios, PBS,
…

2. congeladores de -20 ºC para el almacenamiento de
suero, aditivos (glutamina, antibióticos) y soluciones
enzimáticas (tripsina, colagenasa,…).

3. congeladores de -80 ºC para el almacenamiento a
largo plazo de los aditivos del medio (suero, glutamina,
antibióticos,…) y de sustancias especialmente sensibles
(factores de crecimiento, mitogenos, inductores,…).

2.5 Equipo de esterilización : autoclave y
equipo de filtración.

La necesidad de asepsia para el cultivo de tejidos se
extiende no sólo al medio en que se realiza el trabajo
sino muy especialmente a los recipientes en que se realiza el
cultivo, a los medios líquidos o sólidos, y a los
instrumentos que puedan entrar en contacto con éste en
algún momento de su manipulación (pipetas, puntas
de pipeta automática, pinzas, tubos, material variado de
vidrio…).

Para esterilizar todo este material, de variada
naturaleza se emplean una serie de métodos :
irradiación con radiación
gamma o rayos X,
esterilización por gas, autoclavado, filtración,…
En el laboratorio general de cultivo de tejidos se suele disponer
de : equipo de filtración y autoclave. La
esterilización por gas, y la irradiación son
técnicas propias de grandes instalaciones,
por ejemplo hospitalarias, o industriales.

2.5.1 Equipos de filtración.

En la actualidad se dispone de unidades de
filtración estéril (por ej. Millipore,
Gelman,
…), muy recomendables para el trabajo rutinario. Sin embargo,
su elevado coste por unidad hace que en muchos casos aún
se empleen unidades reutilizables como pueden ser las unidades
Swimmex de Millipore.

Estos equipos de filtración constan o bien de una
fuente de vacio conectada a un kitasato dotado de una unidad de
filtración esterilizada por autoclavado, o bien de una
bomba peristaltica que fuerza el flujoo de solución a
través de una unidad de filtración hermética
(por ejemplo las ya citadas Swimmex de la empresa
Millipore). En
ambos casos la esterilización se produce al atravesar la
solución un filtro de poro 0.22 um.

2.5.2 Autoclave.

Un autoclave es un instrumento que permite la
esterilización por calor tanto de sólidos como de
líquidos. La esterilización se realiza
habitualmente a 121 ºC, 1 atmosfera de
sobrepresión durante un tiempo superior a 20 min. Un
autoclave de uso normal en el laboratorio de cultivo de tejidos
suele disponer de temporizador y regulador de presión, y
en algunos casos de un ciclo de secado para permitir secar el
material sólido (material de vidrio, instrumentos
quirúrgicos, tubos,…).

2.6 Otros instrumentos : centrífugas,
contador de células electrónico ("cell counter"),
equipo de purificación de agua,  balanzas, pH-metro,
pipeteadores…

Además del equipo antes citado el laboratorio de
cultivo de tejidos deberá estar equipado con otros
instrumentos que, o bien no son imprescindibles para un
laboratorio de tamaño pequeño (por ej. el contador
electrónico de células), o bien son instrumentos
que forman parte de un laboratorio de uso más general
(centrífugas, equipo de purificación de agua,
balanzas, pH-metro, pipeteadores…).

2.6.1 Centrífugas.

En el laboratorio de cultivo de tejidos es necesario
disponer de una centrífuga refrigerada, preferentemente
con posibilidades de usar en ella desde tubos de pequeño
volumen (1 a 2
ml) a botellas de gran capacidad (250 a 500 ml). Normalmente,
para la mayor parte de las aplicaciones bastará con un
instrumento que desarrolle hasta 2000 xg.

La centrífuga se ha de instalar dentro de lo
posible alejada de las cabinas de flujo laminar, para evitar las
turbulencias de aire que ge

2.6.2 Contador electrónico de células
("cell counter").

Un contador electrónico de células es un
instrumento capaz de contar y medir partículas en
suspensión. Este instrumento fue comercializado por
Coulter
Electronics, y a pesar que posteriormente se han
desarrollado métodos alternativos es aún hoy en dia
el mecanismo más empleado.

2.6.3 Equipo de purificación de
agua.

Es de gran importancia en la preparación de los
medios, de los aditivos, o en cualquier solución que pueda
estar en contacto con el cultivo, una absoluta esterilidad y
ausencia de sustancias que puedan provocar alguna
alteración al cultivo. Por ello se utiliza siempre agua de
la máxima calidad (tipo MilliQ, Millipore)
obtenida mediante equipos de doble destilación o de intercambio iónico
y filtración. Es muy importante la eliminación de
apirógenos, y restos de materia
orgánica.

2.6.4 Pipeteadores

3.
Quirófano

3.1 Precauciones Universales

Son medidas para reducir el riesgo de transmisión
de enfermedades
infectocontagiosas relacionadas con el trabajo del Equipo de
Salud. Estas precauciones deben ser agregadas a las
Técnicas de Barrera apropiadas para disminuir la probabilidad de
exposición a sangre, otros
líquidos corporales o tejidos que pueden contener
microorganismos patógenos transmitidos por la sangre
(2).

Universalidad: Las medidas deben involucrar a todos los
pacientes de todos los servicios,
independientemente de conocer o no su serología. Todo el
personal debe seguir las precauciones estándares
rutinariamente para prevenir la exposición de la piel y de
las membranas mucosas, en todas las situaciones que puedan dar
origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre
o cualquier otro fluido corporal del paciente. Estas
precauciones, deben ser aplicadas para TODAS las personas,
independientemente de presentar o no
patologías.

Uso de barreras: Comprende el concepto de
evitar la exposición directa a sangre y otros fluidos
orgánicos potencialmente contaminantes, mediante la
utilización de materiales adecuados que se interpongan al
contacto de los mismos. La utilización de barreras (Ej.
guantes) no evitan los accidentes de exposición a estos
fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente
(3).

Medios de eliminación de material contaminado:
Comprende el conjunto de dispositivos y procedimientos adecuados
a través de los cuales los materiales utilizados en la
atención de pacientes, son depositados y
eliminados sin riesgo.

ELEMENTOS DE
PROTECCIÓN PERSONAL

USO DE LOS ELEMENTOS DE PROTECCIÓN
PERSONAL

Los elementos de protección personal son un
complemento indispensable de los métodos de control de
riesgos para proteger al Anestesiólogo colocando barreras
en las puertas de entrada para evitar la transmisión de
infecciones. Sin embargo debe recordarse que muchos de los
elementos de protección personal en instituciones
de salud no fueron diseñados para ese propósito
sino para evitar la contaminación de campos
quirúrgicos y la transmisión de microorganismos de
paciente a paciente a través del personal de salud, por lo
cual tienen esa doble función.

De acuerdo con el procedimiento a
realizar, se determina el uso de elementos de protección
específicos tales como:

1. __ Uso de mascarilla y protectores oculares en los
   procedimientos que se generen gotas de sangre o líquidos
   corporales. Con esta medida se previene la exposición de
   mucosas de boca, nariz y ojos, evitando que se reciban
   inóculos infectados.
2. __ Uso de mascarilla buconasal: protege de eventuales
   contaminaciones con saliva, sangre o vómito, que
   pudieran salir del paciente y caer en la cavidad oral y nasal
   del trabajador. Al mismo tiempo, la mascarilla impide que
   gotitas de saliva o secreciones nasales del personal de salud
   contaminen al paciente, debe usarse en los pacientes en los
   cuales se halla definido un plan de
   aislamiento de gotas.
3. __ Uso de braceras: para evitar el contacto del
   antebrazo y brazo con sangre o líquidos corporales en
   procedimientos invasivos como partos normales, cesárea,
   citología y odontología, entre otros.
4. __ Uso de guantes: Reducen el riesgo de
   contaminación por fluidos en las manos, pero no evitan
   las cortaduras ni el pinchazo. Es importante anotar que
   el
   empleo de guantes tiene por objeto
   proteger y no sustituir las prácticas apropiadas de
   control de infecciones, en particular el lavado correcto de las
   manos. Los guantes deben ser de látex bien
   ceñidos para facilitar la ejecución de los
   procedimientos. Si se rompen deben ser retirados, luego
   proceder al lavado de las manos y al cambio
   inmediato de estos. Si el procedimiento a realizar es invasivo
   de alta exposición, se debe utilizar doble guante. El
   guante se diseñó para impedir la
   transmisión de microorganismos por parte del personal de
   salud a través de las manos; por tal motivo cuando se
   tengan los guantes puestos deben conservarse las normas de
   asepsia y antisepsia. Para personal de oficios varios y el
   encargado de manejo de residuos, los guantes deben ser
   más resistentes, tipo industrial.
5. __ Delantal de caucho: Es
   un protector para el cuerpo; evita la posibilidad de
   contaminación por la salida explosiva o a presión
   de sangre o líquidos corporales; por ejemplo, en
   drenajes de abscesos, atención de heridas, partos,
   punción de cavidades y cirugías, entre
   otros.
6. __ Polainas: Se utilizan para trabajadores de la
   salud que estén expuestos a riesgos de salpicaduras y
   derrames por líquidos o fluidos corporales.
7. __ Gorro: Se usa con el fin de evitar en el
   trabajador de la salud el contacto por salpicaduras por
   material contaminado y además evita la
   contaminación del paciente con los cabellos del
   trabajador de salud.

Procedimientos invasivos:

Para los efectos de nuestra profesión,
consideraremos a todo paciente contaminado y por lo tanto
deberemos cuidarnos con todos mediante el uso de estas medidas.
Se entiende por invasivo todos los procedimientos que irrumpen la
barrera tegumentaria o mucosa del paciente. Las precauciones en
los procedimientos invasivos son:

• Uso de guantes y tapa boca
• Protección para los ojos (en procedimientos
  que pueden provocar salpicaduras de sangre, fluidos o
  fragmentos óseos).
• Las sobretúnicas se usan para
  protección durante procedimientos invasivos con riesgo
  de salpicaduras.
• Cuando un guante se rompe, se debe retirar ambos
  guantes, lavarse las manos con agua y detergente por arrastre y
  colocarse otros nuevos.
• Todo material cortopunzante usado durante el
  procedimiento invasivo deberá ser desechado en
  recipientes descartables adecuados.
• Los materiales deben ser transportados en recipientes
  adecuados a los lugares de procesamiento.
• La ropa contaminada será depositada en bolsas
  plásticas y transportada para el
  procesamiento.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD
PARA EL ÁREA DE CIRUGÍA.

1. __ Utilice permanentemente el equipo de
   protección personal concerniente a gorro y tapabocas; en
   procedimientos invasivos utilice además, monogafas,
   guantes, braceras y delantal plástico.
2. __ Utilice el equipo de aspiración
   mecánico el succionador para la aspiración de
   secreciones de boca y faringe. Evite su manipulación
   directa.
3. __ Cambie oportunamente los recipientes de drenaje o
   aspiración del paciente, secreciones sangre, orina,
   materia fecal.
4. __ Clasifique la ropa médica y
   quirúrgica utilizada en los diferentes procedimientos,
   teniendo en cuenta que puede ser contaminada o sucia. Disponga
   la ropa contaminada, es decir, aquella que contiene sangre,
   secreciones y otros fluidos, provenientes de pacientes, en
   bolsa roja; la ropa sucia en bolsa verde.
5. __ Envíe las muestras de laboratorio en los
   recipientes adecuados, teniendo en cuenta las normas
   específicas para laboratorio clínico.
6. __ Envíe a patología las muestras de
   tejidos u órganos, en recipientes adecuados que
   contengan formol a las concentraciones indicadas, debidamente
   rotulados y con tapa.
7. __ Coloque el material anatomo-patológico, las
   placentas y aquel resultante de amputaciones en bolsa
   plástica, rotulándola como "Riesgo
   Biológico – Material Anatomopatológico", sellarla
   y entregarla al personal del Aseo para su disposición
   final.
8. __ El material contaminado con fluidos corporales
   (guantes, gasas, compresas, etc.) debe ser depositado en bolsa
   roja separado del material
   anatomopatológico.
9. __ Efectúe desinfección y limpieza en
   las áreas quirúrgicas empleando las
   técnicas correctas y las diluciones adecuadas de los
   desinfectantes, de acuerdo a los Procedimientos básicos
   de limpieza y desinfección.
10. __ Maneje los equipos e instrumental siguiendo las
    técnicas de asepsia: desinfección,
    desgerminación y esterilización
    específicas para cada elemento (4).

PRECAUCIONES
UNIVERSALES

1. Uso de precauciones de barrera: empleo de
guantes, batas, mascarillas y protectores para los
ojos.

2. Lavado de manos y de otras partes inmediatamente
después de la contaminación con secreciones
bucales, nasales, lágrimas, orina, sangre y otros fluidos
del paciente.

3. Prevenir lesiones que causan agujas, bisturís,
tijeras, láminas de tapones de sueros, ampolletas rotas, y
otros objetos cortantes. Se deberán disponer de
contenedores adecuados para todos los objetos que puedan
ocasionar lesiones en la piel.

4. El personal de quirófanos con cortaduras en
las manos o antebrazos o lesiones exudativas en estas partes,
deberán evitar el contacto directo con los pacientes,
hasta que sanen completamente.

5. Las áreas del quirófano contaminadas
con sangre o líquidos corporales, deberán limpiarse
y descontaminarse con hipoclorito de sodio al 10% u otro
desinfectante con características bactericidas y
viricidas.

6. Utilizar técnicas que produzcan un alto nivel
de desinfección, para esterilizar equipo que haya estado
en contacto con membranas mucosas de los pacientes, por ejemplo,
hojas de laringoscopio.

7. Una recomendación importante, es que los
anestesiólogos, los residentes de anestesia y las
enfermeras de quirófano se vacunen contra la hepatitis
B.

La CLASA recomienda a los anestesiólogos lo
siguiente:

1. Revise la máquina de anestesia al iniciar sus
labores. El aparato debe ser hermético y tener
válvula para drenar fuera del quirófano los
anestésicos excedentes.

2. Emplee flujos bajos. Preferentemente menores de 2
litros; utilice siempre oxímetro.

3. En todos los circuitos
pediátricos coloque el dispositivo adecuado para expulsar
fuera del quirófano los anestésicos
excedentes.

4. Utilice lo menos posible el circuito semicerrado. Si
no puede evitar su empleo adáptele una válvula de
evacuación.

5. Emplee con mayor frecuencia los bloqueos
anestésicos nerviosos.

6. Emplee con mayor frecuencia las técnicas de
anestesia intravenosa total, clásica o
multimodal.

7. Los anestésicos halogenados, úselos con
flujos bajos y con válvula de evacuación. Utilice
oxímetro.

8. Potencialice sus anestesias inhaladas, con clonidina,
AINES, morfínicos y bloqueos nerviosos locales.

9. Haga las gestiones necesarias (preferiblemente en
grupo) para
que se instale en los quirófanos extractores que recambien
el volumen del aire ambiente 20 veces cada hora.

10. Evite que el personal femenino trabaje en los
quirófanos los primeros tres meses del embarazo.

11. Cuando en el quirófano sean usados los rayos
X protéjase con delantal de plomo.

12. Si se usa el rayo láser
protéjase con lentes especiales.

13. Exija dotación de equipo anestésico de
buena calidad y completo, incluyendo circuitos circulares
cerrados para niños y
recién nacidos.

14. Exija que su quirófano cuente con
oxímetro, monitor
electrónico de presión arterial, capnógrafo
y electrocardioscopio.

15. Concientice a los residentes de
anestesiología para que lleven a la práctica estas
recomendaciones (5).

4. Manual de
seguridad para operaciones en laboratorios de
biotecnología y de tipo biológico

4.1 MANIPULACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE PRODUCTOS
QUÍMICOS

Para su correcta manipulación y almacenamiento es
imprescindible que el usuario sepa identificar los distintos
productos peligrosos, de acuerdo con lo dispuesto en el Real
Decreto 363/1995, de 10 de marzo, por el que se aprueba el
Reglamento sobre declaración de sustancias nuevas y
clasificación, envasado y etiquetado de sustancias
peligrosas. Dicho texto legal ha
sufrido diversas modificaciones, la última de las cuales
ha tenido lugar por el Real Decreto 99/2003, de 24 de enero que
recoge, entre otras, las siguientes definiciones:

• Sustancias: Elementos químicos y sus
  compuestos en estado natural o los obtenidos mediante cualquier
  procedimiento de producción, incluidos los aditivos
  necesarios para conservar la estabilidad del producto y las
  impurezas que resultan del proceso
  utilizado, excluidos los disolventes que puedan separarse sin
  afectar la estabilidad ni modificar la
  composición.
• Preparados: Mezclas o
  disoluciones compuestas por dos o más sustancias
  químicas.

Asimismo, el citado Reglamento distingue las 15
categorías diferentes de sustancias peligrosas, que se
indican en la tabla III.

Tabla III. Clasificación de sustancias
peligrosas

Para facilitar al usuario la identificación de
estas sustancias, el Reglamento ha previsto la obligatoriedad de
poner en el etiquetado unos símbolos (pictogramas) dibujados en negro
sobre fondo amarillo-naranja, que representan la peligrosidad de
cada tipo de productos.

Se distinguen los siguientes pictogramas:

Acompañando a los símbolos, se incluyen
las indicaciones de peligro pertinentes, así como la
mención de los riesgos específicos en forma de
frases "R" y de consejos de prudencia o frases
"S".

2.1 Identificación de sustancias y preparados
peligrosos

Aunque el Real Decreto 363/1995 hace referencia a
sustancias peligrosas, en su anexo VI se establecen los criterios
generales de clasificación y etiquetado, tanto de
sustancias, como de preparados peligrosos. La elección de
símbolos y asignación de frases de riesgo en
función del tipo de sustancia o preparado, se lleva a cabo
del siguiente modo:

2.1.1 Grupo de sustancias y preparados explosivos,
comburentes e inflamables

• Sustancias y preparados explosivos: Se les
  asigna el pictograma y símbolo "E" y la
  indicación de peligro "explosivo", siendo
  obligatorio además, incluir una frase de riesgo que
  puede ser, según la sustancia de que se trate, alguna de
  las siguientes:
• • R2: Riesgo de explosión por choque,
    fricción, fuego u otras fuentes de
    ignición.
  • R3: Alto riesgo de explosión por
    choque, fricción, fuego u otras fuentes de
    ignición.
• Sustancias y preparados comburentes: Se les
  asigna el pictograma y símbolo "O", así
  como la indicación de "comburente", siendo
  obligatorio incluir alguna de las frases de riesgo que se
  indican a continuación, de conformidad con los
  resultados de los ensayos de
  laboratorio:
• • R7: Puede provocar incendios.
  • R8: Peligro de fuego en contacto con
    materias combustibles.
  • R9: Peligro de explosión al mezclar
    con materias combustibles.
• Sustancias y preparados extremadamente
  inflamables: Este concepto se aplica a sustancias y
  preparados cuyo punto de inflamación (Pi) es inferior a
  0 ºC (Pi < 0 ºC) y su temperatura o
  punto de ebullición (Pe) inferior a 35
  ºC. Se les asigna el pictograma y símbolo
  "F+" y la indicación de
  "extremadamente inflamable", debiendo incluir la
  frase:
• • R12: Extremadamente
    inflamable.
• Sustancias y preparados fácilmente
  inflamables: Concepto aplicable a sustancias y preparados
  que, entre otras propiedades, tengan un Pi
  comprendido entre 0 y 21 ºC (0 ºC < Pi
  < 21 ºC). Se les asigna el pictograma y símbolo
  "F", así como la indicación
  "fácilmente inflamable" y la frase:
• • R11: Fácilmente
    inflamable.
• Sustancias y preparados inflamables: No
  requieren pictograma, si bien cuando se trate de sustancias y
  preparados líquidos, cuyo Pi sea igual o
  superior a 21 ºC e inferior o igual a 55 ºC, se les
  asigna la frase:
• • R10: Inflamable.

Dependiendo de las características y naturaleza
de las sustancias y preparados de este grupo, pueden asignarse
otras frases, tales como:

• R4: Forma compuestos metálicos
  explosivos muy sensibles.
• R5: Peligro de explosión en caso de
  calentamiento.
• R7: Puede provocar incendios.
• R15: Reacciona con el agua
  liberando gases extremadamente inflamables.
• R17: Se inflama espontáneamente en
  contacto con el aire.
• R30: Puede inflamarse fácilmente al
  usarlo.

Finalmente, la obligación de poner el
pictograma "E" hace que sea facultativa la
inclusión de los pictogramas "F" y
"O".

2.1.2 Grupo de sustancias y preparados muy
tóxicos, tóxicos y nocivos

Aunque existe una acusada tendencia por parte de muchos
usuarios, a calificar erróneamente como
"tóxicas" numerosas sustancias y preparados
peligrosos que, si bien presentan un marcado efecto agresivo para
la salud humana (corrosivo, irritante…), distan mucho de tener
lo que debe conocerse realmente como efectos
tóxicos. El Real Decreto 363/1995, define en su
artículo 2º los siguientes conceptos:

• Muy tóxicos: Sustancias y preparados
  que por inhalación, ingestión o
  penetración cutánea en muy pequeña
  cantidad pueden provocar efectos agudos o crónicos e
  incluso la
  muerte.
• Tóxicos: Sustancias y preparados que
  por inhalación, ingestión o penetración
  cutánea en pequeñas cantidades pueden provocar
  efectos agudos o crónicos e incluso la muerte.
• Nocivos: Sustancias y preparados que por
  inhalación, ingestión o penetración
  cutánea pueden provocar efectos agudos o crónicos
  e incluso la muerte.

La aparente ambigüedad de estos conceptos queda
completamente despejada en el anexo VI del citado Real Decreto
363/1995, modificados por el Real Decreto 99/2003, de 24 de
enero, al establecer criterios cuantitativos de
clasificación, basados en parámetros
toxicológicos, como la dosis letal 50
(DL50) oral y cutánea y la
concentración letal 50 (CL50)
inhalatoria, en los términos que se indican en la tabla
IV.

Tabla IV. Sustancias y preparados muy tóxicos,
tóxicos y nocivos

Conviene señalar que el concepto dosis letal
50 (DL50) hace referencia a la cantidad
mínima de sustancia, expresada en mg/Kg de peso, capaz de
provocar efectos letales en la mitad de la población de animales de
experimentación escogida para el ensayo
(rata, conejo…), por la vía de entrada en el organismo
seleccionada para tal (oral, cutánea, etc.). Por su parte,
la concentración letal 50 (CL50) es un
concepto similar, pero reservado a la vía
inhalatoria.

Tras estas consideraciones, la elección de
símbolos y asignación de frases de riesgo para este
grupo de sustancias y preparados se realiza de la siguiente
manera:

• Sustancias y preparados muy tóxicos: Se
  les asigna el pictograma y símbolo
  "T+", así como la indicación de
  peligro "muy tóxico", siendo obligatorio incluir
  también alguna de las frases de riesgo que se indican
  seguidamente, según las características del
  producto:
• • R26: Muy tóxico por
    inhalación.
  • R27: Muy tóxico en contacto con la
    piel.
  • R28: Muy tóxico por
    ingestión.
  • R39: Peligro de efectos irreversibles muy
    graves.
• Sustancias y preparados tóxicos: Se les
  asigna el pictograma y símbolo "T" y la
  indicación de peligro "tóxico", debiendo
  incluirse también, alguna de las siguientes frases de
  riesgo:
• • R23: Tóxico por
    inhalación.
  • R24: Tóxico en contacto con la
    piel.
  • R25: Tóxico por
    ingestión.
  • R39: Peligro de efectos irreversibles muy
    graves.
  • R48: Riesgo de efectos graves para la
    salud en caso de exposición prolongada.
• Sustancias y preparados nocivos: Se les asigna
  el pictograma y símbolo "Xn" y la
  indicación de "nocivo", incluyendo además,
  alguna de las frases de riesgo que a continuación se
  indican:
• • R20: Nocivo por
    inhalación.
  • R21: Nocivo en contacto con la
    piel.
  • R22: Nocivo por
    ingestión.
  • R65: Nocivo. Si se ingiere puede causar
    daño pulmonar.
  • R68: Posibilidad de efectos
    irreversibles.

A modo de ejemplo, una sustancia o preparado
sólido, que tras los oportunos ensayos de laboratorio
respondiera a las siguientes propiedades:
– DL50 para la rata por vía oral: 100
mg/Kg
– DL50 cutánea para el conejo: 250 mg/Kg
– CL50 inhalatoria para la rata (del aerosol): 0,5
mg/litro/4 horas
se clasificaría como tóxica por
ingestión, inhalación y en contacto con la
piel, se identificaría con el símbolo
"T" y debería llevar la siguiente
combinación de frases: R23/24/25.

Asimismo, una sustancia o preparado líquido
cuyas características sean:
– DL50 para la rata por vía oral: 500
mg/Kg
– DL50 cutánea para la rata: 1500 mg/Kg
– CL50 inhalatoria para la rata (del vapor): 30
mg/litro/4 horas
se clasificaría como nociva por contacto con la piel
y por ingestión, se identificaría como
"Xn" y llevaría la siguiente combinación
de frases: R21/22.

Por último, conviene precisar que la
obligación de poner el pictograma "T" hace que
sea facultativa la inclusión de los pictogramas
"X" y "C".

2.1.3 Grupo de sustancias y preparados corrosivos,
irritantes y sensibilizantes

• Sustancias y preparados corrosivos: Se les
  asigna el pictograma y símbolo "C" y la
  indicación de peligro "corrosivo", debiendo
  incluir alguna de las siguientes frases de riesgo:
• • R34: Provoca quemaduras.
  • R35: Provoca quemaduras
    graves.
• Sustancias y preparados irritantes: Se les
  asigna el pictograma y símbolo "Xi" y la
  indicación de "irritante", incluyendo
  además, alguna de las frases de riesgo que se
  indican:
• • R36: Irrita los ojos.
  • R37: Irrita las vías
    respiratorias.
  • R38: Irrita la piel.
  • R41: Riesgo de lesiones oculares
    graves.
• Sustancias y preparados sensibilizantes: No
  tienen pictograma propio, si bien se les asigna el
  símbolo "Xn", la indicación de peligro
  "nocivo" y alguna de las siguientes frases, en
  función del lugar donde pueden ejercer su acción agresiva:
• • R42: Posibilidad de sensibilización
    por inhalación.
  • R43: Posibilidad de sensibilización
    en contacto con la piel.

Conviene señalar que la obligación de
poner el pictograma "C", hace que sea facultativa la
inclusión del pictograma "X".