Aislamiento y supervivencia de esporas Bacillus thuringiensis en maíz en almacén y en el ambiente

1. Resumen
2. Introducción y
   Antecedentes
3. Material y
   Métodos
4. Resultados y
   Discusión
6. Literatura
   citada
7. Anexo

Resumen.

La bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) es
una alternativa ecológica para reducir el daño de
insectos-plaga en la agricultura y
evitar el uso de pesticidas químicos.

Bt produce al final de su ciclo de vida,
un complejo espora y cristal ó δ-endotoxina que
intoxica insectos-plaga (IP) de los
ordenes: Lepidoptera, Diptera y Coleoptera. Si a la
aplicación de éste complejo sobre hojas, los IP no
lo consumen, el cristal expuesto a la radiación
solar se desnaturaliza y las esporas mueren rápidamente,
excepto en almacén de granos en donde, éste factor
físico no existe, en ese ambiente esporas y cristales de
Bt persisten por mayor tiempo, que en
el exterior.

Los objetivos de
este trabajo
fueron: 1) aislar esporas variedades de Bt tóxicos
a insectos-plaga de granos de almacén, 2) Establecer la
supervivencia de esas esporas en maíz almacenado y
expuesto a la intemperie.

Para ello se colectaron 120 muestras de grano de los
mercados: San
Juan, Nicolás Bravo y Vasco de Quiroga de la ciudad de
Morelia, Michoacán, México.
Los granos se pasteurizaron y sembraron en agar nutritivo,
ahí se buscaron las colonias típicas de Bt y
en las células,
la espora con el cristal característico.

La supervivencia de las esporas de un Bt aislado
de un grano y Bt var kurstaki HD-1 del producto
comercial Dipel MR analizó en maíz,
colocado en un simulador de almacén y otra se expuso a la
intemperie, para medir el efecto de la luz solar sobre
la viabilidad de las esporas Bt.

Los resultados indican que de las 120 muestras de granos
de mercados en Morelia se recuperaron dos aislados que se
denominaron: Bt1 y Bt2 de girasol, equivalente al
1.6 %. Este resultado sugiere que la frecuencia de aislamiento de
las esporas de la bacteria, fue proporcional al tiempo de
almacenamiento de
esos granos. Mientras que la supervivencia de las esporas
Bt en maíz, fue dependiente de su exposición
a la radiación solar. En contraste en el maíz en
almacén, la persistencia de las esporas de Bt fue
alta. Finalmente Bt1 se identificó como var.
morrisoni y Bt2 como var.
kurstaki.

Palabras clave: biopesticida, radiación
solar, bacteria, insecto-plaga.

Introducción y Antecedentes.

Los insectos-plaga son uno de los factores que limitan
la producción agrícola, dado que atacan
cultivos vegetales (CV) desde su siembra a la cosecha e incluso
en el almacen. Por ello el Declorodifenildicloroetano (DDE) y
otros organoclorados se aplican durante el ciclo completo del CV,
para protegerlos del ataque de estos IP. El continuo y excesivo
uso de estos pesticidas, les indujo resistencia
genética.

Actualmente esta situación no cambia y su
control se
realiza con dosis elevadas de pesticidas en consecuencia para
1989, se reportaron mas de 500 especies de IP de los ordenes
Lepidoptera, Diptera y Coleoptera, tolerantes.
Además los pesticidas contaminan: aire, suelo, agua y
eliminan insectos benéficos (Alpuche, 1991).

Una alternativa para el control de IP, es el
microbiológico con ventaja sobre el químico por su
especificidad; su inocuidad a humanos, animales,
plantas y su
relativo bajo costo (Herrero
et al., 2001).

Ejemplo de algunas de las especies del género
Bacillus, son los de tipo entomotóxico y/o
entomopatógeno como: B. thuringiensis (Bt),
B. popilliae, B. larvae y B. sphaericus
(Kiselek, 1979; Krieg, 1980; Moir y Smith, 1990), de estas
especies, Bt se comercializa desde los años 50, por
lo que en la actualidad es clave en la racionalización de
los pesticidas (Rowe y Margaritis, 1989;
Sánchez-Yáñez, 2004).

Aunque por otro lado en el mercado se venden
semillas transgénicas con el gen de Bt, responsable
de la producción del cristal para evitar su
desnaturalización en el ambiente en un intento por mejorar
el control biológico de IP, con éxito
relativo y que es causa de controversia por su aún no
predecible impacto negativo ecológico (Doping et
al., 2000), como ocurre en la aspersión convencional
del complejo espora-cristal, un problema práctico de la
aplicación del éste es la persistencia de las
primeras en el ambiente, pues influyen en la toxicidad del
cristal (Sánchez-Yáñez y
Peña-Cabriales, 2000).

Las esporas de Bt, se aíslan con relativa
facilidad de diversos ambientes, en función de
su origen se recuperan: del suelo, del filoplano de plantas
(Smith y Couche, 1991), de larvas enfermas de insectos, de
productos
almacenados y de alimentos
balanceados para animales (Pinnock et al., 1971;
Sztejnberg y Blakeman, 1973), aunque si existe diferencia en la
frecuencia de aislamiento de las esporas de Bt, entre esos
ambientes, ya que que son las responsables de su distribución cosmopolita (Goodfellow,
1968a; Goodfellow y Dawson, 1978b), en el suelo (De Lucca et
al., 1981; Martín y Travers, 1989), asi se reporta que
las esporas fueron viables en hojas de fríjol y
maíz no mayor de 72 horas (Sánchez-
Yáñez y Peña-Cabriales, 2000), debido a la
acción
bactericida de la radiación solar (Alekseev et al.,
1982). Aunque otros reportes señalan periodos de
persistencia mayores de 15 días (Luna- Olvera y
Peña-Cabriales, 1996) similar a lo observado en los
productos almacenados como granos y alimentos balanceados para
animales. En los cuales las esporas de variedades de Bt se
recuperan en por ciento del 7% al 30 % y un periodo de
supervivencia de semanas (Waliszweski y Pardo-Sedas, 1991;
Meadows et al., 1992), como se informa en las hojas del
tabaco en
almacén, en el que obtuvo un aislamiento de esporas de
variedades de Bt del 20% (Kaelin et al.,
1994).

En general la frecuencia de recuperación de las
esporas de estas variedades de Bt, es mayor en un ambiente
protegido de la radiación solar, por ello se considera al
ambiente de almacén, como uno de los sitios con mayor
probabilidad
en detectar de epizootias causadas por Bt con esporas de
más de una variedad de Bt, lo que apoya que en este
sitio el un número de esporas viables es suficientes para
causar, no sólo la intoxicación del IP,
también una verdadera enfermedad (Dulmage y Aizawa, 1982;
Lambert y Perferoen, 1992).

Con base en lo anterior los objetivos de este trabajo
fueron i) Analizar esporas de variedades de Bt en granos
de almacén. ii) Establecerr la supervivencia de sus
esporas en maíz en almacén y expuesto a la
intemperie.

Material y Métodos.

I. Origen de muestras.

Se colectaron 120 diferentes muestras de grano de
almacén de los mercados de San Juan, Independencia
y Vasco de Quiroga de la Ciudad de Morelia, capital del
estado de
Michoacán, México.

II. Recuperación de las esporas
Bt.

El aislamiento de las variedades de esporas de
Bt, se suspendió 1g/ de granos de los mercados en
tubos de 18x 150 mm con 10 ml de solución salina (NaCl
0.85%,p/v), los tubos se agitaron/ 1 min en un vortex
(Thermolyne). Los granos con daño por IP se trituraron y
posteriormente ambas muestras se pasteurizaron a 65°C/ 13
minutos y aumentar la probabilidad de la recuperación de
variedades de esporas Bt. Se tomó 0.1 ml del
pasteurizado y se inoculó en tubos con 10 ml de caldo
nutritivo (Bioxon) g/l: peptona gelatina 5.0, extracto de carne
de res 3.0, pH 6.9
± 0.2, los que se incubaron/24
h y se resembraron con aza bacteriológca en cajas con agar
nutritivo o AN (Bioxon) g/l: peptona gelatina 5.0, extracto de
carne de res 3.0, agar 15.0, pH 6.9± 0.2, las cajas se incubaron a
30°C/72 h.

Entonces se buscaron las colonias típicas de
Bt y en ellas se buscaron sus esporas con los cristal
característicos, mediante tinción simple y la
especifica de Anthony para esporas bacterianas (Martín y
Travers, 1989). La purificación de las posibles variedades
de Bt se udó la técnica de
pasteurización en el aislamiento de las esporas de
Bt, var kurstaki HD-1 del producto
DipelMR (Shell, Co).

Se realizó un bioensayo horizontal de la
toxicidad de Bt1 contra gorgo (Sitophilus zeamaise
L) como lo indica Dulmage (1970) y posteriormente la
identificación bioquímica
con los criterios aceptados para éste género y
especie bacteriana (Krieg, 1980; Rowe y Margaritis,
1989).

Conservación de las esporas de
Bt.

Los aislados y las esporas de Bt se cultivaron en
caldo nutritivo e incubaron a 30°C/72 h, se mezclaron en
turba estéril (121°C/2 h) en tubos de 18×150 mm con
tapón de rosca (Sánchez-Yáñez et
al., 2002; 2004) y se mantuvieron en refrigeración a 10°C para asegurar la
viabilidad y pureza.

III. Microscopia electrónica de los aislados de
Bt.

La observación de las esporas y cristales
producidos por Bt1 y Bt2 se utilizó el
microscopio
electrónico de barrido (MEB) JEOL Model JSM 6400, del
Instituto de Investigaciones
Metalúrgicas de la UMSN. En este ensayo tomo
una asada de cada Bt y se fijó en una placa
metálica (1×1 cm) de oro, estas se
sumergieron en glutaraldehido/45 min. y se deshidrataron en
alcohol al 90%
para su posterior observación al MEB, luego se recubrieron
con una capa de oro (metalización). Las microfotografias
se tomaron a 5,000 y 10,000 magnificaciones.

Otra técnica empleada para la observación
de Bt fue la siguiente: después de fijar en la
placa metálica de oro se sumergió en
glutaraldehído al 70% durante 30-45 minutos, luego se le
aplicó un baño metálico, con oro o plata. Y
se observo en el MEB (Guillen-Rodríguez et al.,
2001).

IV. Marcaje de los aislados y cepa de
Bt.

La persistencia de las esporas en los granos de
maíz en almacén y al intemperie se
seleccionó Bt2, por su abundancia y como
comparación se usó la cepa comercial de Bt
HD-1. Se diseñaron dos medios de
cultivo selectivos para la recuperación de las esporas de
Bt con base a su patrón de susceptibilidad a los
antibióticos de un Multidisco *MR Gram positivo
(Sanofi).

La cepa HD-1 con resistencia a ampicilina en AN,
agregada estéril por filtración con membrana
milipore (Gelman, Co) en concentración de 1500 µg/ml
(Lakeside). En el caso del aislado de Bt2 se agrego al AN
750 µg/ml del mismo antibiótico en la forma
señalada. Para inhibir el crecimiento de hongos en el AN
se usaron U/ml de nistatina (Mendoza et al.,
2003).

V. Producción y recuperación del
complejo espora/cristal de Bt.

Ambos aislados de Bt se usaron para la
producción del complejo espora/cristal, se crecieron
individualmente en matraces de 1000ml con 500 ml de: caldo soya
tripticasa (CST), caldo soya tripticasa lactosa (CSTL) y caldo
nutritivo (CN).

Cada matraz se incubó a 30°C/96h, Tiempo al
cual por con el microscopio se buscó un 95% de
esporas/cristales, con la técnica de Anthony como
indicador del final del crecimiento de Bt. Luego cada
caldo se centrifugó a 10,000 rpm/10 minutos, u
cada/complejo espora-cristal se recuperó por el método de
coprecipitación lactosa-acetona y se realizó el
bioensayo horizontal con gorgo (Sitophilus zeamaise. L) y
con gusano cogollero (Spodeptera frugiperda. L).
Finalmente se determino la especificidad toxica del complejo de
Bt1 y 2 (Dulmge, 1970).

VI. Supervivencia de esporas en granos de maíz
en almacén y expuestos a la intemperie.

Las esporas y cristales de Bt2 y de HD-1 se
ajustaron a 4×106 esporas/semilla, luego se asperjaron
en el maíz, que se colocó en costales de
polipropileno de 15 x10 cm, como conservan en
almacén.

Los costales se introdujeron en un simulador de un
ambiente de lamacen de 50 x 50 cm, y esteblecer el tiempo de
supervivencia de las esporas, mediante el análisis de un 1 g de maíz, a
intervalos de 24 h,con la técnica de cuenta viable en
placa, la disgregación de las esporas unidas a los granos,
se uso peptona (Difco) al 0.1% y 10 ppm de N- laurilsarocosine
sodium Salt (LSD, Sigma), así se determinó la
densidad de
las esporas de Bt2 en granos con y sin pasteurizar.
Mientras que el maíz asperjado con Bt2 se expuso al
intemperie, para medir el efecto de la radiación solar en
el tiempo de supervivencia de esporas de Bt, con
intervalos de 12 h, por ello se tomó 1 g de maíz
como se describió con las esporas de Bt en
maíz en almacén, simultáneamente
registró la temperatura y
la humedad relativa del ambiente durante el periodo del
experimento (Guillen- Rodríguez et al.,
2001).

VII. Análisis
estadístico.

La persistencia de las esporas de Bt2 y la cepa
comercial HD-1 en granos de maíz se evaluó
con la prueba estadística por comparación de
medidas de Tukey.

Resultados y Discusión

En la figura 1 se muestra una
magnificación de cristal sintetizado por Bt1 que se
recuperó de granos en almacén, con cristales
rectangulares y cúbicos e incluso amorfos, lo cual sugiere
que tentativamente en esos granos existe también la
típica variedad morrisoni de Bt en
almacén (Sánchez-Yáñez,
2004.

En la figura 2 muestra la morfología
típica de las esporas y cristales bipiramidales producidos
por Bt2 a la 96h, lo que sugiere que se trata de la
variedad kurstaki.

La figura 4 presenta el resultado del bioensayo
horizontal del complejo espora-cristal de Bt2 el que
define que su toxicidad, con una mortalidad de 100% al gusano
cogollero (Spodoptera frugiperda. L) IP del orden
Lepidoptera. ; lo cual fue dependiente de la
composición del cultivo en donde creció (Dulmage,
1970) y del origen del Bt (Lambert y Perferoen, 1992).
Estos resultados apoyan que en productos de almacén como
los granos es posible detectar más de una variedad de
Bt diferente a la común en este sito: la
morrisoni.

Los resultados de este bioensayo y las pruebas
bioquímicas indican que se trata de Bt variedad
kurstaki

En la figura 5 se presenta el resultado del bioensayo
horizontal del complejo espora-cristal de Bt1 en el
gorgojo del maíz (Sitophilus zeamaise. L). En el
que se registró una mortalidad del 70%, lo que depende en
cierta nivel de la composición químico del medio de
cultivo donde Bt1 se cultivó, este resultado apoya
que la variedad de Bt1 aislada pertenece morrisoni,
que es solo tóxica para ciertos IP del orden
Coleoptera como el gorgojo.

En el cuadro 1 se muestra el tiempo de supervivencia de
las esporas de Bt2 y la cepa HD-1 en granos de maíz
en el almacén a temperatura promedio de 20°C ±
1 y humedad relativa del 10%. Mientras que a la intemperie fue
10°C a las 5 AM, 25°C a las 12 AM; 35°C a las 16 pm,
humedad relativa de 40%; entre 17-19 pm de 28°C y humedad del
30% entre h durante la primavera. En donde la visibilidad de las
esporas de ambos aislados de Bt fue mayor en el
almacén y restringida cuando el maíz se expuso al
ambiente (Pinock et al., 1971), se cree que la muerte de
las esporas fue causada por la acción germinada de la luz
solar, que se relacionó con la carencia de las
pequeñas proteínas
solubles en el ácido (PPSA) de la cubierta de las esporas
de Bt, las PPSA les proporcionan a las esporas tolerancia a la
radiación solar (Benoit et al., 1990, Griego y
Spence, 1979; Ignoffo y García, 1978).

Así se explica que en almacén de granos en
ausencia de la luz solar, a relativa baja humedad, se evita la
actividad depredadora de microorganismos que eliminan las esporas
de Bt, lo que favorece la supervivencia de las esporas de
la bacteria por un mayor tiempo, en contraste con la menor
persistencia de las esporas de Bt en ambiente abierto o
intemperie (Guillén-Rodriguez et
al.,2001).

Esto justifica en parte el empleo de
complejos encapsulados que contienen la δ-endotoxina y la
espora de Bt, para aumentar su
persistencia y la eficacia del
control biológico de insectos-plaga de almacén y
agrícola.

En el cuadro 2 se muestra la caracterización
bioquímica de Bt1 que apoyan variedad
morrisoni como la utilización de glucosa, de
almidón, la hidrólisis de caseína, y la
síntesis de catalasa así como su
incapacidad para la producción de ureasa
(Guillén-Rodríguez et al .,
2001).

La presencia de esporas de Bt de distintas
variedades, supone que durante la siembra, cosecha y transporte de
los granos desde el campo al almacén se dieron las
condiciones para su contaminación con esporas de diversos tipos
de Bt; probablemente provenientes de insectos y
pájaros con contacto con las plantas (Dulmage y Aizawa,
1982).

A pesar de que las esporas de otras variedades de
Bt no son comunes y su persistencia es relativamente
breve, se supone que el tiempo en el cual, esos granos se
colectaron y luego almacenaron prolongo la supervivencia de las
esporas de la bacteria por esa ruta (De Lucca et al.,
1982; Demock et al., 1989).

Conclusión

Los granos de almacén son una fuente potencial
para el aislamiento de variedades de Bt tóxicos
para insectos-plaga agrícola y de almacén. Aunque
en el caso de los insectos-plaga que atacan granos, su control
por Bt, puede ser relativamente sencillo por la
persistencia de sus esporas puesto que se comprobó que sus
esporas tienen baja viabilidad expuesta al ambiente
abierto.

Dedicatoria. A Juan Manuel Sánchez
Marín por su ejemplo de disciplina y
trabajo

Agradecimientos. Al proyecto 2.7
(2005-2006) de la CIC de la UMSNH, por el apoyo económico
para la presente publicación. Al IIM-UMSNH por las
facilidades del microscópico de barrido y su
técnico Francisco Solorio por su apoyo en este trabajo, a
Beatriz Noriega por su paciencia en la escritura.

Literatura
citada.

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cereus in soil supplemnt with grass or manure. Plant soil. 83
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ANEXO

Figura 1. Microfotografía
electrónica de barrido de las esporas y cristales
cúbicos, rectángulares y amorfos producidos por
Bacillus thuringiensis (Btl) variedad morrisoni
aislada de granos en almacén, cultivo de 96 h (10,000
magnificaciones). E= espora, C=cristal.

Cuadro 1. Persistencia de esporas de Bacillus
thuringiensis (Bt2) y B. thuringiensis var
kurstaki (HD-l) asperjados en maíz en
almacén y expuesto a la intemperie.

Letras iguales sin diferencia estadística
Tukey ( PO.Ol), CV 10%. Datos
ambientales: material ~ métodos.

Cuadro 2 Comparación de las
características bioquímicas de Bacillus
thuringiensis (Bt1) de granos almacenados y Bacillus
thuringiensis variedad morrisoni**.

(+)= respuesta positiva; (-) = respuesta negativa,
los resultados son el promedio de 4 repeticiones **Cepa de
referencia, donada por el Laboratorio.
H.T. Dulmage, Facultad de Ciencias
Biológicas-Universidad Autónoma de Nuevo
León. Monterrey, Nuevo León,
México.

Villegas, M. J1.,

2Guillen, R, D.,

Martínez, M, H

2*Sánchez-Yáñez J.
M.

1Ecología Microbiana,
2*Microbiología Ambiental.

1*autor correspondiente

Instituto de Investigaciones
Químico-Biológicas. Universidad Michoacana de San
Nicolás de Hidalgo, Ed. B-1, Ciudad Universitaria. C.P.
58030. Morelia, Michoacán, México.