Diversidad de bacterias fijadoras de N2 en teocintle y maíz

1. Resumen
2. Introducción y
   antecedentes
3. Materiales y
   métodos
4. Resultados y
   discusión

Resumen

El teocintle (Zea mays mexicana L) es una
gramínea silvestre a partir del cual por
domesticación se obtuvo el maíz actual, y aunque
ello está bien documentado, no así el tipo de
microorganismos fijadores de N2 asociados a su
raíces.

Los objetivos de
esta investigación fueron analizar y comparar
las bacterias fijadoras de nitrógeno (BFN) asociadas a las
raíces de teocintle y maíz, en el municipio de
Morelia, estado de
Michoacán en el suroeste de México. Para lo cual se
colectaron: raíces, suelo de
rizósfera y suelo sin raíces de plantas crecidas
en invernadero y en el campo.

En base al análisis de la densidad total de
las poblaciones cultivables: a) heterotrófica aerobia, b)
fijadora de nitrógeno y c) Burkholderia
spp.

A cada aislado se le midió su actividad de
reducción de acetileno (fijación biológica
del N2). Las características bioquímicas
usadas para su identificación fueron: morfología
macro y microscópica, así como su capacidad de
oxidación/fermentación de carbohidratos.

Los resultados indican una ligera diferencia en la
densidad, de la población aerobia heterotrófica
cultivable de BFN, mayor en el maíz que en el teocintle
aunque en general ambas plantas comparten aparentemente el mismo
tipo de poblaciones bacterianas en los tres niveles analizados,
excepto en las raíces de las plantas crecidas en
invernadero, en donde las poblaciones bacterianas totales fueron
inferiores.

La actividad de reducción de acetileno en las
bacterias aisladas de teocintle y maíz fue variable
dependiente de su origen. Mientras que el comportamiento
bioquímico de los aislados de ambas plantas, fue similar.
En donde el grupo
bacteriano predominante fue un bacilo Gram Negativo (-):
Azotobacter spp, además de otros bacilos
Gram(-) no identificados.

Los géneros en menor proporción
Burkholderia spp y Klebsiella spp, ambos con
capacidad de fijar N2. Estos resultados apoyan la
teoría
de que el teocintle tiene una estrecha relación con el
maíz, investigación en progreso intenta
fortalecerla.

Palabras clave: Teocintle, domesticación,
maíz, raíces, bacterias libres fijadoras de
N2.

Introducción y
antecedentes.

El teocintle (Zea mays mexicana L) es considerado
como el ancestro del maíz actual (9,30) en general los
argumentos que se han postulado para ello son genéticos
(8), botánicos (10) y evolutivos (29). Con escasa información en relación a su
interacción a nivel radical con bacterias
fijadoras de N2 (SFN), y al parentesco de esta población
con la conocida en el maíz moderno (11, 23).

En general las BFN, comúnmente en las
raíces del maíz son: Azotobacter chroccocum,
Clostridium spp, Azospirillum spp, A.
brasilense, y A. lipoferum, aunque también se
han reportado, miembros de la familia
Enterobacteriaceae (15,16) como los dominantes en esa zona de la
planta, así se ha demostrado que: Enterobacter
spp, Klebsiella spp, Pantoea spp y principalmente
Rahnella aquatilis, colonizan las raíces de
maíz (4,18).

Con la aplicación de la técnica del
modelo
espermósfera (33), se ha detectado una mayor variedad de
BFN en las raíces de maíz (18), en función de
la variedad, de planta, clase de suelo
y región geográfica donde se cultiva; de los
géneros más reportados, se señalan:
Azospirillum sp, (32) Herbaspirillum, (2)
Azotobacter chroococcum, (23) Klebsiella terrigena,
(4) Rhanella aquatilis, (4) Bacillus circulans,
(4,31) Paenibacillus polymyxa, (37) y Burkholderia
sp, (14). En México, se han aislado géneros
similares como: Azospirillum spp, (25) mientras que en el
Noreste de México se reportó como microflora
dominante a Azotobacter beijerinckii, asociada a
las raíces de la variedad del maíz híbrido
H-417 (27).

En la actualidad, atención especial ha recibido el género
Burkholderia spp (antes Pseudomonas), por fijar
N2, su actividad promotora del crecimiento
vegetal, su capacidad antagonista a fitopatógenos de
rizósfera (13,36), así como por metabolizar
pesticidas, compuestos recalcitrantes y por su multirresistencia
a antibióticos. (17,35). En contraste con la mínima
investigación, referente a Burkholderia fijador
N2, en raíces del teocintle. Aunque investigaciones
exploratorias señalan que existen grupos
bacterianos similares a los reportados en el maíz
(28).

Los objetivos de esta investigación fueron
analizar y comparar la microflora fijadora de nitrógeno
asociada a las raíces de teocintle y maíz, en el
municipio de Morelia, Mich. México.

Materiales y métodos.

1. Origen de las gramíneas.

Las poblaciones bacterianas se aislaron de raíces
de teocintle y maíz cultivados en macetas en invernadero,
y en suelos
agrícolas del municipio de Morelia, estado de
Michoacán, México.

Los medios de
cultivo usados fueron agar nutritivo (AN) para cuantificar la
población heterotrófica cultivable (22), medio
mineral sin nitrógeno (Watanabe) para el aislamiento de
bacterias fijadoras de nitrógeno (9) con la siguiente
composición: Solución A: (g/L):
ZnSO4.7H2O, 0.43;
MnSO4.H2O, 1.30;
NaMnO4.2H2O, 0.75;
H3BO3, 2.8;
CuSO4.5H2O, 0.026;
CoSO4.7H2O, 0.07.
Solución B: (g/L):
MgCO4.7H2O, 2.0;
CaCl2.2H20, 2.0;
FeSO4.7H2O, 0.44; EDTA, 0.40.
Solución C: (g/L): K2HPO4, 60;
KHPO4, 40. Mezclar: solución B, 50 mL;
solución C, 15 mL; solución A, 20 mL/L.

Se adicionan (g/L): glucosa, 5;
manitol, 5; almidón, 4.5; ácido málico, 3.5;
agar bacteriológico 18.0 Agar. Pseudomonas cepacia
ácido azalaíco. tryptamine (PCAT) semiselectivo
para el género Burkholderia. (g/L).
MgSO4 0.1; Ácido azalaíco 2.0;
Tryptamine 0.4; K2HPO4, 4.0;
KH2PO4, 4.0; extracto de levadura, 0.02. el
pH se
ajustó a 5.7 (11).

2. Aislamiento de las poblaciones bacterianas
seleccionadas.

El análisis microbiológico de las plantas
se realizó a los 60 días después de la
siembra en invernadero y en el campo, con el cuidado necesario
para evitar dañarla, según el método de
Tjepkema y Van Serkum (34).

La raíz se sacudió suavemente, para
desprender el suelo adherido, se cortó la raíz
desde el cuello de la planta, se pesaron 5 g de suelo sin
raíces, por separado 5 g suelo adherido a la raíz y
además la misma cantidad de raíces, en todos los
casos se suspendieron en 45 mL de solución salina
estéril, cada muestra se
agitó á 200 rpm durante 30 minutos y se
diluyó (10-2 a 10-6).

De cada nivel de la planta se sembraron 0.2 mL en agar
Watanabe, en agar PCAT y en AN. El período de
incubación fue de 24 h para las muestras en AN y de 72 h
para Watanabe y PCAT. Por resiembra en Watanabe se aislaron y
seleccionaron las BFN sospechosas, en base a: su forma,
tamaño, color,
elevación y borde. Procedimiento
similar se empleó para el aislamiento y selección
Burkholderia spp en PCAT.

3. Actividad reductora de acetileno (fijación
biológica de N2) o ARA.

Para demostrar en forma indirecta la fijación
biológica de nitrógeno se realizó la prueba
de ARA (20,21). Las bacterias, fueron suspendidas en tubos de 18
x 150 mm, con 3.0 mL de medio sólido sin N Watanabe, la
población se ajustado a 1×103 bacterias/mL con
el tubo No.1 de Mac Farland.

Los tubos se sellaron con tapones de hule. Se incubaron
á 35°C por 48 h, y con una jeringa Hamilton de 5.0 mL,
a cada tubo se le extrajo e1 10% de la fase gaseosa y se le
inyectó el mismo volumen de
acetileno.

El etileno producido en cada tubo, se determinó
después de 1 á 4 días de incubación a
temperatura
ambiente, por
cromatografía de gases (Beckman
modelo GC- 72-5) empacado con una columna Porapack Q.

4. Identificación presuntiva de las
BFN.

Se realizó la identificación bioquímica
parcial, por esquema de pruebas para
medir su actividad oxidativa/fermentativa sobre carbohidratos:
glucosa, sacarosa, lactosa, almidón. Su actividad
proteolítica en: gelatina, en triptofano (indol) y la
producción de H2S a partir de
aminoácidos azufrados, así como la
utilización de citratos como única fuente de
carbono, y el
tipo de respiración: catalasa y oxidasa
(20,21).

Resultados y
discusión.

La figura 1 muestra la población
heterotrófica viable (PHC), de los suelos donde se
cultivó teocintle y maíz sin diferencia
numérica debido al tipo de técnica de cuenta viable
empleada, la que no proporcionó información de la
condición de la población en su hábitat
natural en términos de latencia y/o actividad.

A la PHC se le consideró como el 100% y se
usó de referencia para la población de BFN, en este
caso el porcentaje de la densidad se atribuyó al pobre
contenido de N en los suelos (29) en los cuales ambas se
cultivaron, los valores
porcentuales de 19.3 y 16.3 se encuentran en el intervalo
reportado, para otras gramíneas bajo condiciones
semejantes (6,25), en tanto que el porcentaje de
Burkholderia spp, sugiere que este género no
está adaptado a la pobreza
nutricional del suelo, pues en general las investigaciones
realizadas la ubican como una bacteria de la rizósfera,
básicamente por su exigencia nutricional. (7).

BFN: Bacterias Fijadoras de
Nitrógeno

La figura 2 muestra el efecto de la rizósfera del
teocintle y maíz sobre las poblaciones de BFN, y
Burkholderia spp, en donde, fue evidente que la
condición nutricional más conveniente para el
maíz, favoreció una mayor estimulación de
estas poblaciones, que para las asociadas a las raíces de
teocintle, sujeto al stress
nutricional del suelo, pobre en materia
orgánica, nitrógeno y otros minerales
necesarios para desarrollo
normal.

Efecto rizósfera positivo semejante se
observó en el por ciento de Burkholderia spp (5) su
densidad, así como el de otros grupos de rizósfera
similares, es dependiente del estado de salud de la planta
hospedera, lo que significa que bajo stress
nutricional, las poblaciones microbianas asociadas a las
raíces, disminuyen su número, en comparación
con la densidad de los microorganismos de las raíz,
reportadas en plantas cultivadas en suelos fértiles (36)
de referencia de Burkholderia vietnamiensis TVV-75,
aislada de la rizósfera de arroz y la detectada en el
aislado SM-3c3 recuperado de un maíz híbrido, y en
el aislado ST -5c obtenido de las raíces de
teocintle.

La segunda tendencia con valores
elevados, representada por los aislados ST -5c5 y
ST-5b10 recuperados del suelo adherido a raíces
y rizósfera de teocintle y por el aislado SM-

3C4 proveniente de raíces de maíz. Estos
valores son relativos, ya que las diferencias entre grupos
bacterianos, e incluso entre especies son el resultado de sus
necesidades nutricionales específicas, (3, 18,19) en las
que la ARA se realizó.

En general, para esta prueba se emplean, como referencia
las condiciones óptimas de géneros conocidos como:
Azotobacter sp, Clostridium sp o
Azospirillum sp, las que no necesariamente son las
adecuadas para BFN aisladas de plantas silvestres, como el
teocintle (23,24), lo anterior sugiere que aún aquellas
que mostraron menos ARA, no deben considerarse menos capaces para
esta actividad, pues no se sabe con precisión, cuales son
las condiciones óptimas para inducir una mayor
ARA.

No obstante los valores cualitativos mostrados en esta
tabla, confirman que en las raíces de teocintle, como en
las de maíz híbrido, existe una población de
Burkholderia sp capaz de fijar N2 (29), lo
anterior se apoya en la detección de los genes Nif en este
grupo.

Este es uno de los primeros reportes que señala a
Burkholderia (con genes Nif), de un origen diferente al
arroz, como fijador de N2, pues Burkholderia
vietnamiensis es hasta la actualidad, el único miembro
del grupo reconocido con esta propiedad
(35), diferente a las cepas de Burkholderia spp
recuperadas de las raíces de maíces cultivados en
suelos franceses y australianos, en donde aunque el grupo fue
dominante, no mostraron la capacidad de fijar N2
(37).

Tabla 1. Actividad reductora de acetileno por
Burkholderia spp aisladas de suelo adherido a
rizósfera y de raíces de teocintle y maíz,
en el Municipio de Morelia, Mich.

a Número de
repeticiones.

b Promedio de la actividad máxima de
producción de
C2H4/día/tubo

* Burkholderia ST Burkholderia sp aislada
de teocintle. SM Burkholderia sp aislada de
maíz.

Estos resultados sugieren que cuando el maíz fue
exportado de América
al mundo, hubo cambios en la interacción planta/bacteria
que causaron la segregación y/o selección de las
bacterias con capacidad de fijar N2. Sin embargo, es
necesaria investigación más fina para dar solidez a
este argumento.

En la tabla 2 se muestra el comportamiento
bioquímico de las BFN identificadas parcialmente como
Burkholderia sp, independiente de su origen de aislamiento
(teocintle o maíz), o de la parte de la planta de donde se
recuperó (suelo adherido y/o raíces), lo que
muestra homogeneidad en los exudados radicales de ambas
gramíneas, al menos para la selección de las BFN y
apoya el argumento de la cercana relación entre teocintle
y maíz. (12,36).

El comportamiento bioquímico de las otras BFN
diferentes a Burkholderia, presenta un patrón
semejante al de las enterobacterias, del género
Klebsiella spp, de amplia distribución en raíces de diversas
plantas (6,20,21).

La tabla 3 presenta el patrón bioquímico
de las BFN de teocintle y de maíz que no tuvieron
relación con Burkholderia sp y/o el grupo
entérico. Según el método de aislamiento
utilizado fue en realidad, la población dominante y por
tanto, representativa en ambas plantas: Este grupo mostró
una actividad sacarolítica
(oxidación/fermentación: glucosa, manitol,
sacarosa), como se reporta para cierta clase de BFN, sin embargo
por su pobre actividad proteolítica, su morfología
microscópica y colonial se concluye parcialmente que se
trata de un miembro del género Azotobacter,
común en las raíces de gramíneas (1,14,
25).

En este análisis exploratorio de las BFN
asociadas al teocintle y maíz no se logró detectar
diferencia en términos numéricos y de la diversidad
de FBN, aunque no se usaron herramientas
de biología
molecular. Sin embargo, será necesario para confirmar
estos resultados, el empleo de
huellas genéticas que permitan con exactitud definir el
posible efecto de la domesticación del teocintle sobre la
diversidad de las BFN heterotróficas que habitan el
sistema radical
del maíz.

Tabla 2. Comportamiento bioquímico de
Burkholderia spp recuperadas de raíces de teocintle
(Zea mays sp mexicana L) y maíz (Zea
mays L), del Municipio de Morelia, Mich.

*Cepa de referencia. Reacción (+) positiva, (-)
negativa. TSI=Agar Triple Azúcar.
LIA= Agar Hierro Lisina.
SIM=H25, Indol Movilidad. ST= aislado de Teocintle.
SM= aislado de maíz. a= Suelo alejado de raíz. b=
Suelo Adherido a raíz. c=Raíz.

Tabla 3. Comportamiento bioquímico de
bacterias fijadoras de nitrógeno dominantes, aisladas de
suelo con raíces suelo adherido a raíz y
raíces de teocintle (Zea mays sp mexicana L)
y maíz (Zea mays L) en el Municipio de Morelia,
Mich.

*Cepa de referencia. Reacción (+) positiva, (-)
negativa TSI=Agar Triple Azúcar LIA=Agar Hierro Lisina
SIM=H2S, Indol Movilidad T=aislado de Teocintle. M=aislado de
maíz, a= suelo alejado de raíz, b= Suelo adherido a
raíz c=Raíces. **Aislados de comportamiento similar
de diferente parte de la planta.

Dedicatoria: a Rosario y Esthela Sánchez
Yánez, un ejemplo de responsabilidad y superación personal.

Agradecimientos.

Al apoyo económico de la CIC/UMSNH por el
proyecto 2.7
(2005-2006). Estudio de la microbiota fijadora de N2 asociada a
las raíces de teocintle (Zea mays sp
mexicana L) y maíz (Zea mays L) y al
programa con
título similar, en cooperación con el CONACYT/CNRS
Universidad
Claude Bernard, Lyon, Francia. clave
E130.642/México .

Bibliografía.

1. Alexander, M. (1977). Microbiología de la rizósfera en
introducción a la microbiología del
suelo. AGT Ed. Cap. 25 pp. 447-461.

2. Baldani, J. l., Baldani, V. L. D., Dobereiner., J.
(1986). Caracterization of Herbaspirillum
seropedicae gen. nov., sp. nov., a root-associated
nitrogen-fixing bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 36:
86-93.

3. Behling, M. C. H. and Boddey, R. M. (1987).
Estimation of biological nitrogen fixation associated with 11
ecotypes of Panicum maximum grown in
nitrogen-15-labeled Soil. Agronomy J. 79: 558-562.

4. Berge, O., Heulin, T., Achouak, W., Richard, C.,
Bally, R., and Balandreau, J. (1991). Berlin Rahnella
aquatilis a Nitrogen-fixing enteric bacterium associated with
the rhizosphere of wheat and maize. Can. J. Microbiol. 37:
195-203.

5. Caballero-Mellado, J. and Martínez-Romero, E.
(1994). Limited genetic diversity in the endophytic sugarcane
bacterium Acetobacter diazotrophicus. Appl.
Environ. Microbiol. 60: 1532- 1537.

6. Comunicación personal. Balandreau, J.
(1999). Analysis of biodiversity in Burkholderia genus:
Laboratorie de Ecologie Microbienne du Sol. UMR-CNRS 5557CUCB,
Lyon Bat 741,69622 Villeurban, Lyon Francia.

7. Comunicación personal. Vela-Muzquiz, R (1992).
Azotobacter able to grow in humic acids of Soil. Deparment
of Biological Science. University of North Texas, Denton, Texas
USA.

8. Curl, E.A. and Truelove, B. 1986. The rhizosphere.
Spring-Verlang. Germany.

9. Chávez, D. B. L. (1995). Dinámica de poblaciones de las semillas de
teocintle (Zea mays L spp mexicana) Schader
Iltis, bajo condiciones de stress. Tesis
profesional U.M.S.N.H. Morelia Mich. (Inédita).

10. Fuentes–Ramírez,
L. E., Caballero-Mellado, J., Sepúlveda, J.,
Martínez R, E. (1999).

Colonization of sugarcane by Acetobacter
diazotrophicusis inhibited by high N fertilization. FEMS.
Microbol. Ecol. (En prensa)

11. García, G. M. M.,
Sánchez-Yáñez, J. M., Peña-Cabriales,
J. J. y Moreno-Zacarías, P. E (1995).Respuesta del
maíz (Zea mays L) a la inoculación con
bacterias fijadoras de nitrógeno. Terra 13:
71-79.

12. Gillis, M., Tran, V V, Bardin, R., Goor, M., Hebbar,
P., Willems, A. (1997) Plyphasic taxonomy in the genus
Burkholderia leading to an emended description of the
genus and proposition of Burkholderia vietnamiensis sp.
nov. For N2-fixing isolates from rice in Vietnam. Int.
J. Syst. Bacteriol. 45: 274-289.

13. Hebbar, K. P., Atkinson, D., Tucker, W. and Dart, P.
J. (1992). Supression of Fusarium moniliforme by
maize root-associated Pseudomonas cepacia. Soil Biol.
Biochem. 24: 1009-1020.

14. Hebbar, K. P., Martel, M. H., Heulin, T (1994).
Burkholderia cepacia, a plant growth promoting
rhizobacterial associate of maize. In: «Improving plant
productivity with Rhizosphere Bacteria». Proc. Intem.
Workshop on Plant Browth-Promoting Rhizobacteria, Adelaide, South
Australia, March 7-11, 1994. M. H. Ryder, P. M. Stephens and G.
D. Bowen, eds. CSIRO pp 201-203.

15. Heulin, T, Berge, O., Mavingui, P., Gouzou, L.,
Hebbar, K. P. and Balandreau, J. (1994). Bacillus polymyxa
and Rahnella aquatilis, the dominant N2-fixing bacteria
associated with wheat rhizosphere in french soils. Eur. J. Soil
Biol., 30: 35-42.

16. Heulin, T, Rahman, M., amar, A. M. N., Rafidison,
Z., Pierrat, J. C. and Balandreau, J. (1989). Experimental and
mathematical procedures for comparing N2-fixing
efficiencies of rhizosphere diazotrophs. J. Microbiol. Methods.
9: 163-173.

17. Holmes, A., Govan, J. and Goldstein. R. (1999).
Agricultural use of Burkholderia

(Pseudomonas ) cepacia: A Threat to human health?
. J. General. Microbiol. (In press)

18. Khammas, K. M., Ageron, E., Grimont, P. A.D. and
Kaiser, P. (1994). The nitrogen fixing bacteria from Iraqi
rice-field soils. Eur. J. Soil Biol. 30: 101-106.

19. Krotzky, A. and Wemer, D. (1987). Nitrogen fixation
in Pseudomonas stutzeri. Arch. Microbiol. 147:
48-57.

20. Llovera, L. J., Sánchez-Yañez, J. M.
& Peña-Cabriales. (1994). Reducción de
acetileno por bacterias asociadas a raíces de especies de
nopal (Opuntia L.). Rev. lat-Amer. Microbiol. 36:
183-189.

21. Loera, TM. L., Sánchez-Yáñez,
J. M., Peña-Cabriales, J. J. (1996).Acetylene reduction
activity on the root of cactaceous plants. Rev.
Lat-Amer.Microbiol. 38: 7-15.

22. Luna, O. H. A. y Sánchez-
Yáñez, J. M. (1999). Manual de
prácticas de Microbiología del Suelo. Facultad de
Ciencias
Biológicas. U.A.N.L. Iraed. Monterrey. N. L.
México.

23. Martínez-Toledo, M. V,
González-López, J., De La Rubia, T,
Ramos-Cormenzana, A. (1985). Isolation and caracterization of
Azotobacter chroccoccum from the roots of Zea
mays L. FEMS Microbol. Ecol. 31: 197-203.

24. Mavingui, P., Berge, O. and Heulin, T (1990).
Inmunotrapping of Bacillus polymyxa in soil and in the
rhizosphere of wheat. Symbiosis 9: 215-221.

25. Mavingui, P., Laguerre, G., Berge, O. and Heulin, T
(1992). Genetic and phenotypic diversity of Bacillus
polymyxa in soil and in the wheat rhizosphere. Appl. Environ.
Microbiol. 58: 1894-1903.

26. Posada, C. S. (1983). Aislamiento e
inoculación de bacterias fijadoras de N21 um obtenidas de
raíces de maíz (Zea mays L) tesis de
licenciatura Facultad de Ciencias Biológicas U.A.N.L.
Monterrey N.L pp: 3-8. (Inédita).

27. Posadas-Campos, S., Ramírez-Castañeda,
J., Peña-Cabriales, J.J., Farias-Rodríguez R, y
Sánchez-Yáñez, J.M. 2002. Aislamiento y
efecto de inoculación de maíz (Zea mays L)
con bacterias benéficas de raíz. CUATRO VIENTOS
30:24-28.

28. Sánchez, H. L. (2000). Microflora Fijadora de
Nitrógeno Asociada a la Rizósfera de Teocintle
(Zea mexicana L). Tesis. Facultad de Ciencias
Químicas. Benemérita Universidad Autónoma de
Puebla, Puebla, Pue, México, realiza en el Laboratorio de
Microbiología Ambiental del Instituto de Investigaciones
Químico-Biológicas Universidad Michoacana de San
Nicolás de Hidalgo, Morelia, Mich, México.
(Inédita).

29. Sánchez-Yáñez, J. M., Tran, V.
V., Balandreau, L. (1998). Aislamiento de la microflora fijadora
de N2 asociada a teocintle y maíz; Microbiología
ambiental; Instituto de Investigaciones Químico
Biológicas-Universidad Michoacana de San Nicolás de
Hidalgo/CONACYT/ MEXICO/CNRS Ecologie Microbienne du sol
Université Claude- Bemard/FRANCIA. Reporte
Técnico.

30. Sánchez-Velásquez, L. R.,
Lorente-Adame, R. G. (1993). Sobrevivencia de los frutos de
Zea diploperenis en diferentes hábitats.
BIOTAM 5:29- 33.

31. Stolp, H. (1952). Beitrdg zur frage der beziehungen
zwischen mikroorganismen und

hvheren oflanzen. Archv f/r Mikrobiologie, 17:
1-29.

32. Tarrand, J. J., Krieg, N. R., Dobereiner, J. (1978).
A taxonomic study of the Spirillum lipoferum group
with descriptions of a new genus Azospirillum gen. nov.
and two species Azospirillum lipoferum (Beijerinck) comb.
Nov. and Azospirillum brasilense sp. Nov. Can. J.
Microbiol. 24: 967-980.

33. Thomas-Bauzon, D., Weinhard, P, Villecourt, P, and
Balandreau, J. (1982). The spermosphere model. 1. Its use
in growing, counting, and isolating N2-fixing bacteria
from the rhizosphere ofrice. Can. J. Microbiol 128:
922-928.

34. Tjepkema, J. & Van, Berkum. P. (1977). Acetylene
reduction by soil cores maize and sorghum in Brasil. Appl.
Environ. Microbiol. 33: 626-629.

35. Tran, V V, Gillis, M. K. P. (1993). Isolation from
the rice rhizosphere, of a new Species of nitrogen-fixing
Pratobacteria, belonging to the genus Burkholderia.
In Nitrogen fixation with non- Legum. 299-309. Ed. N.A. Hegazi,
M. Fayez y M. Monib.

36. Viallard, V, Poirier, L., Coumoyer, B., Haurat, J.,
Wiebkin, S., Ophel Keller and Balandreau. J. (1998).
Burkholderia graminis. Nov. a rhizospheric Burkholderia
spp, and a reassesment of (Pseudomonas) phenazinium,
(Pseudomonas) pyrracinia and (Pseudomonas) glathei as
Burkholderia. Int. I. Syst. Bacteriol. 48:
594-563.

37. Weihs, V, Jagnow, R. J. (1988). Occurrence of
Bacillus polymyxa in the rhizosphere of grasses and
cereals in the North East of Germany and some of its
characteristics. In. Nitragen Fixation: Hundred year after,
Bothe, H., Brujin, F. J. Newton, W. E.
eds, Stuttgart, Gustav Fischer, p. 795.

Juan Manuel
Sánchez-Yáñez*,

Tran Van Van**

Rodolfo Farias R***

Laboratorio de Microbiología Ambiental, Ecología
Microbiana*** Instituto de Investigaciones
Químico-Biológicas. Universidad Michoacana de San
Nicolás de Hidalgo.,

Ed B-1, C.U. Morelia, Michoacán, .
México

*autor correspondiente

**Centro Nacional para la Investigación Científica
(CNRS)

Universidad Claude Bernard, Lyon, Francia.