Práctica de Laboratorio
La identificación de un aislamiento bacteriano
puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en
la evaluación
de similitudes.
Los ensayos
bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas
bioquímicas convencionales, generalmente determinan la
actividad de una vía metabólica (conjunto de
reacciones
químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en
un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o
no.
Existen diferentes sistemas que
facilitan la realización de tales ensayos, porque proponen
el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la
identificación de un grupo
bacteriano, porque simplifican la interpretación de un
resultado utilizando un valor
numérico, porque proveen los reactivos prontos para su uso
o porque son totalmente automatizables.
Las pruebas o ensayos bioquímicos, son
pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma
clara una determinada característica bioquímica
como presencia o ausencia de una determinada actividad
enzimática, grupo de enzimas o
determinada vía metabólica, crecimiento a una
determinada temperatura,
crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de
ninguna manera un estudio profundo del metabolismo
bacteriano.
GENERAL
Determinar la producción de enzimas en las bacterias.
ESPECÍFICOS
- Determinar la producción de catalasa de
algunos géneros y especies de bacterias. - Determinar la producción de ureasa de algunos
géneros y especies de bacterias. - Determinar la producción de indol de algunos
géneros y especies de bacterias. - Determinar la lucuación de la gelatina de
algunos géneros y especies de bacterias. - Determinar la hidrólisis del almidón de
algunos géneros y especies de bacterias. - Determinar la capacidad oxidativa y/o fermentativa de
algunos géneros y especies de bacterias.
MATERIALES:
- Géneros y especies
- Cultivos puros de:
- Peptona
- SSR
- Hugh y Leifson
- Gelatina
- Triptona
- Cajas de petri
- peróxido de hidrógeno
(H2O2) - reactivo de Kovac’s
- lugol
- parafina
- tira de papel de
acetato de plomo - Tubos de ensayo
- portaobjeto
- Agujas de asa
- Mecheros de alcohol
- Nevera
PROCEDIMIENTO
Producción de Catalasa:
- Coloque una azada de crecimiento (célula) de cada uno de los cultivos sobre
portaobjetos. - Agregue 2 ó 3 gotas de peróxido de
hidrógeno (H2O2) - observe la formación o no de
burbujas.
Producción de ureasa:
- incube en los tubos con medio SSR, que contiene
urea. - Incube a temperatura ambiente y
observe los cambios de color durante 7
dias.
Licuación de la gelatina:
- inocule los cultivos en tubos con gelatina
nutritiva. - incube a 37°C. Mantenga la incubación de 2
a 7 días o hasta que se obtenga una reacción
positiva. - Para observar la hidrólisis, enfríe los
tubos en hielo. La gelatina hidrolizada permanecerá
liquida.
Producción de indol:
- inocule los cultivos en tubos con caldo
nutritivo. - incube a 37°C por 48 horas.
- Al cabo de este tiempo,
añada en los tubos 0.5 ml del reactivo de
Kovac’s. - Mezcle bien por rotación del tubo entre las
manos y examine después de un minuto.
Hidrólisis del almidón:
- inocule los cultivos en caja de petri con
agar-almidón e incube a 30°C durante 5
días. - Al cabo de este tiempo, cubra las cajas con
solución de lugol. - Observe el color que toma el medio.
Prueba O/F (oxido-fermentación):
- Medio de cultivo Hugh y Leifson con glucosa al
1%. - indicador de acidez o alcalinidad: Bromotimol azul,
coloración amarilla indica pH 6 o
menos; coloración azul indica pH de 7 a 8. - De cada cultivo inoculese por el método
de punción dos tubos con el medio indicado, uno de ellos
sin sellar (condiciones aeróbicas) y el otro sellado con
parafina (condiciones anaeróbicas). - incubese a temperatura adecuada por 2 o 3
días. - obsérvese el crecimiento y el cambio de
coloración del medio.
Producción de ácido
sulfhídrico:
- Inocule los cultivo d los microorganismos en caldo
nutritivo. - incube los tubos a 37°C durante 7
días. - Inserta una tira de papel de acetato de plomo en el
tubo y examine el ennegrecimiento del papel.
PRODUCCIÓN DE CATALASA.
La catalasa es una enzima que protege a las células
frente al peróxido de hidrógeno producido en el
metabolismo del oxígeno.
Químicamente, la catalasa es una
hemoproteína de estructura
similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 átomos
de hierro de la
molécula están en estado oxidado
(Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los
estreptococos, la mayoría de las bacterias aerobias y
anaerobias facultativas poseen actividad catalasa. La actividad
catalasa se detecta añadiendo unas gotas de
peróxido de hidrógeno (3%) sobre colonias en medio
que no sea de agar sangre
(daría falsos positivos).
El peróxido de hidrógeno se forma como uno
de los productos
finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos
de carbono. Si se
deja acumular, el peróxido de hidrógeno es letal
para las células bacterianas. La catalasa transforma el
peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno de acuerdo a la siguiente
reacción:
H2O2 ® H2O +
O2 (burbujas de gas)
la rápida aparición y
producción sostenida de burbujas de gas o
efervescencia, indica una prueba positiva.- Cual es la reacción activada por la
catalasa?El gas que se forma en la reacción es
oxígeno. - Cual es el gas presente en las burbujas que se forman
en la reacción positiva? - Como interpreta usted la formación de burbujas
en la prueba de la catalasa?
Las bacterias catalizan la rotura del agua oxigenada
liberando oxígeno libre. Y la producción de
burbujas indica la presencia del enzima.
PRODUCCIÓN DE UREASA
La urea es un compuesto orgánico nitrogenado que
se transforma por algunos microorganismos del suelo, los cuales
producen la enzima ureasa. Como resultado de esta actividad
microbiana el nitrógeno es liberado al suelo en forma
inorgánica. Cuando esta reacción ocurre en medio de
cultivo se alcaliniza y el indicador permite percibir visualmente
el cambio en acidez del medio.
- Cual es la fórmula química de la
urea?
H2N-CO-NH2
LICUACIÓN DE LA GELATINA
La gelatina es una proteína que se obtiene por
hidrólisis parcial del colágeno y proporciona un
sustrato útil para determinar la acción de las
enzimas proteolíticas de los microorganismos.
Proteína + H2O ® polipéptidos +
H2O ® aminoácidos- Cuales son los productos intermedios y finales que se
obtienen de la hidrólisis de las proteínas? - Qué importancia tiene la hidrólisis de
las proteínas cuando ocurre en los suelos?
La hidrólisis de la proteína es
importante porque se obtienen aminoácidos y producen
amoníaco, fosfatos útiles para el
suelo.
PRODUCCIÓN DE INDOL
El indol es uno de los productos de degradación
metabólica del aminoácido triptofano.Las bacterias
que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar
el triptofano con producción de indol, ácido
pirúvico y amoníaco. La producción de indol
es una característica importante para la
identificación de muchas especies de microorganismos. La
prueba de indol está basada en la formación de un
complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo
aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el
principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich descriptos
más adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico
en triptofano.
El indol, ácido piuvico y amoniaco son uno de
los productos de degradación metabólica del
aminoácido triptofano.- Qué compuestos se obtienen mediante la
degradación del triptófano ocasionada por la
acción bacterial? - El enrojecimiento de la capa superficial del cultivo
en tubo de ensayo
¿Qué le indica?
El desarrollo
de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el
caldo, segundos después de añadir el reactivo
indica la presencia de indol y una prueba positiva.
HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN
Los polisacaridos, como el almidón son demasiado
largos para ser transportados al interior de la célula.
Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos
polímeros hasta oligosacáridos o
monosacáridos que pueden usarse como sustratos para
crecer.
La hidrólisis de almidón es analizada en medios
conteniendo almidón en placa. Después de incubar se
inundan las placas con lugol que al unirse con el almidón
intacto forma un complejo púrpura.
Porque la bacteria no hidroliza el almidón,
osea que no hay reacción.- Como explica que el medio tome una coloración
azul uniforme?La presencia de zonas claras advierte la bacteria
productora de amilasa, osea que si hubo
reacción. - Como explica la presencia de zonas claras en el
medio? - Señale algún uso industrial de las
amilasas producidas por microorganismos.
Las amilasas hidrolizan el almidón a dextrinas
y azúcares, y se emplea en color y adhesivos,
clarificación de jugos de frutas, preparaciones
farmaceuticas entre otras aplicaciones.
PRUEBA O/F (Oxido-fermentación)
El medio más comúnmente utilizado es el de
Hugh-Leifson que a diferencia de otros medios de cultivo contiene
una baja concentración de peptonas (0.2 %). A las
concentraciones de peptona habitualmente usadas en otros medios
(1 al 2%), no es posible detectar la baja concentración de
ácidos
que se produce por metabolismo oxidativo de azúcares, ya
que las aminas generadas por el uso aerobio de las peptonas
alcalinizan el medio. La baja concentración de peptona del
medio Hugh-Leifson permite diferenciar los microorganismos
oxidativos de los inactivos frente a la glucosa. En ausencia de
otros aceptores externos de electrones (ej. NO3-), la
oxidación de carbohidratos
es un proceso
estrictamente aerobio, en tanto que la fermentación es un
proceso que no requiere oxígeno. El medio de cultivo es
semisólido.
Cuando se habla de esta prueba sin especificar nada, hay
que suponer que el test se ha hecho
con glucosa, así, cuando se dice que un microorganismo es
oxidante o fermentador se sobreentiende que lo es con respecto al
metabolismo de la glucosa.
La prueba se realiza en dos tubos con medio semisólido y
rectos, que inicialmente son de color verde. Se inoculan por
picadura en el centro del tubo y uno de ellos se recubre con
parafina líquida estéril (que impide el contacto
del medio con el oxígeno atmosférico).
el metabolismo de los azúcares produce
ácidos, tanto en presencia como en ausencia de
oxígeno.- Qué puede usted concluir si como consecuencia
del crecimiento bacterial los dos tubos inoculados aparecen
amarillos?Si el microorganismo es únicamente oxidante ,
después de la incubación sólo
estará amarillo el medio sin cubrir con
parafina. - Si el tubo anaeróbico permanece azul y el
aeróbico amarillo ¿qué puede usted anotar
con relación a los requerimientos de oxígeno de
la especie? - Si ambos tubos permanecen azules ¡qué ha
ocurrido?
La bacteria no crece en glucosa por lo que no hay
cambios en ninguno de los tubos.
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO
SULFHÍDRICO
Muchas bacterias producen sulfuro de hidrógeno
(sulfhídrico) a partir de aminoácidos azufrados
(cisteína o metionina) o tiosulfato.
Que si hubo reacción de
oxidación.- Qué indica el oscurecimiento de papel
impregnado en acetato de plomo? - De algunos ejemplos de alimentos que
durante su descomposición presentan una reacción
de este tipo.
Manzanas, caña de azúcar, papa, banano, plátano,
etc.
Consigne los resultados de las pruebas en el cuadro
adjunto.
PRUEBA | REACCIÓN (+) (-) | CAMBIOS SEGÚN LA | |
CATALASA | + | Presencia de burbujas | |
UREASA | – | No tuvo cambio de color |  |
LUCUEFACIÓN DE LA | + | La gelatina se hidrolizó y | |
INDOL | – | Al agregar el reactivo de Kovac’s no cambio |
|
HIDRÓLISIS DEL | + | Presencia de zonas claras, desaparece el color del |  |
PRUEBA O/F | + | La bacteria solo es oxidantes, asi que Hubo reacción en el tubo |  |
PRODUCCIÓN DE | + | El papel de acetato de plomo se oxido. |
- PELCZAR. M. J, Introducción a la microbiología.
- http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html
http://www.uniovi.es/biologia/docs/asignaturas/segundo/microbiologia.htm- http://www.britanialab.com.ar/espanol/k02_62.html
- Enciclopedia Encarta Microsoft
2001.
Margarita Rodríguez