Endonucleasas de restricción: Son enzimas que hidrolizan los ácidos nucleicos rompiendo enlaces internucleótidos del interior de la cadena. Son producidas principalemnete por bacterias que hidrolizan enlaces fosfodiester del esqueleto del DNA de doble hebra en secuencias específicas. Las endonucleasas de restricción de tipo II son las mas útiles en los métodos de DNA debido a su especificidad de secuencia absoluta, tanto para la reacción de unión como para la de ruptura. Estas enzimas se denominan con tres o cuatro letras que corresponden a la primera letra del género y a las dos o tres primeras letras e la especie del organismo de procedencia. El número señala el orden cronológico de descubrimiento de esa enzima en esa generación.
Casi todas las secuencias nucleotídicas reconocidas por las endonucleasas de restricción poseen un eje de simetría impropio binario, esto es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, lo que recibe el nombre de palíndromes. La rotura se produce en ambas hebras de DNA siendo esta simétrica respecto al eje binario. Las endonucleasas de restricción cortan el DNA generando, bien extremos 3 o 5 de unos cuatro nucleótidos de longitud, denominados extremos cohesivos, o bien extremos romos.
Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar DNA o RNA "in Vitro". La mayoría de estas enzimas requieren un molde y sintetizan una molécula complementaria al molde. Las polimerasas utilizadas con mayor frecuencia son: DNA polimerasa I de E. Coli, el fragmento de Klenow, transcriptasa inversa (utiliza como molde RNA para convertirlo en DNA), la DNA polimerasa del bacteriofago T7, RNA polimerasa de los bacteriofagos SP6, T7 y T3 y la Taq polimerasa. La mayoría de las polimerasas necesitan un pequeño cebador o primer complementario al DNA molde para iniciar la polimerización a partir de ese punto. La transferasa terminal es una polimerasa que no requiere molde y que añade nucleótidos exclusivamente a los extremos de las cadenas preexistentes. Todas ellas requieren Mg2 .
Otras enzimas: Ligasas (une extremos de DNA protuberantes o romos), fosfatasas (eliminan el fosfato de la región 5 de los ácidos nucleicos), quinasas (incorporan fosfatos en el extremo 5 que han dejado las fosfatasas).
Desarrollo de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa
En los años setenta se desarrollaron los métodos que permitieron de manera simple y relativamente rápida para determinar la secuencia nucleotídica de cualquier fragmento de DNA. Estos primeros intentos de secuenciar los ácidos nucleicos siguieron los pasos empleados en la secuenciación de proteínas: romper las moléculas en pequeños fragmentos, determinar su composición de bases y deducir la secuencia a partir de fragmentos solapantes. Este método resulta mas o menos sencillo para proteínas que resultan de la combinación de hasta veinte aminoácidos distintos, pero constituye un problema en el caso de los ácidos nucleicos donde la secuencia resulta de la combinación de únicamente cuatro nucleótidos diferentes.
Reacción en cadena de la polimerasa
En Abril de 1983, Kary Mullis dio a conocer la Técnica de reacción en cadena de la Polimerasa o PCR que es una técnica para la síntesis "in Vitro" de secuencias específicas de DNA con la cual la insuficiente cantidad de ADN ya no es un problema en los procedimientos de Biología Molécular ni en los procedimientos de diagnóstico basados en el estudio de DNA.
La técnica se basa en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers). Son una pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de DNA que se desea amplificar. Partiendo de este principio, la reacción en Cadena de la Polimerasa se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas: 1ª Desnaturalización del ADN doble cadena 2ª Hibridación de los iniciadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras 3ª Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa En la primera etapa (desnaturalización) la doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97ºC). La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya. En el segundo paso (hibridación) los cebadores se unen a las zonas 3´ complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65º C) En la tercera etapa (elongación) se produce la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los desoxinucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. Todos estos pasos se pueden apreciar gráficamente en la Figura 1.
Figura 1: Pasos básicos de la PCR (de Andy Vierstracte 1999) Este proceso se lleva a cabo en un equipo llamado termociclador (fig.2). Este aparato realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta.
Figura 2: Termociclador para reacciones de PCR Observemos en las figuras 3a y 3b, observamos que una vez completado el primer ciclo, disponemos de 2 copias de la muestra original, al final del segundo ciclo tenemos 4, al final del tercero 8…Si los ciclos se producen un número "n" de veces y suponiendo que el número de copias de ADN se duplica en cada ciclo, obtenemos una cantidad de ADN de 2n, por lo que la amplificación se realiza en forma de progresión geométrica.
Figura 3a: Amplificación exponencial del PCR (de Andy Vierstracte 2001)
Figura 3b: Amplificación exponencial del PCR (de M.E. Gilles-González 1997) Es importante recalcar que los productos obtenidos tras la tercera etapa son de dos tipos: "producto corto" y "producto largo". El producto corto tiene una longitud perfectamente definida por los extremos 5´ de los cebadores y contiene exactamente la secuencia que se desea amplificar.Es el fragmento que se almacena de manera exponencial durante la reacción. El producto largo es el que incorpora las cadenas de ADN originales de la muestra y cuyos extremos 3´ no están definidos. Sin embargo, es importante aclarar que al final de la PCR, la cantidad del producto corto sintetizado es muy superior en comparación con el producto largo, por lo generalmente para posteriores estudios, a partir del producto de la PCR, se desestima. (fig. 4).
Figura 4: Detalle de los cuatro primeros pasos de la PCR (de Andy Vierstracte 2001) La detección del producto de la Reacción en Cadena de la Polimerasa se realiza normalmente mediante corrido electroforético (fig 5) dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones. La posterior visualización se puede realizar con bromuro de estudio (lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia, radioactividad.
Figura 5: Preparación del corrido electroforético En la actualidad se desarrollan métodos para poder cuantificar el producto de la PCR, visualizando in situ sobre tejidos (Cao, Y. y cols, 2000). Lo que hace prever un crecimiento, si cabe mayor, del uso de la técnica de la PCR. A continuación trataremos de profundizar en los componentes y parámetros más importantes para obtener una amplificación óptima. Componentes y optimización de la reacción de amplificación: Muestra de ADN Existen una serie de reglas sencillas para que el DNA molde no sea un problema en la reacción:
· Integridad del ADN: no puede estar fragmentado en trozos más pequeños de lo que queremos amplificar.
· Origen de la muestra y proceso de extracción: la muestra no debe llevar agentes quelantes (EDTA) que reducen la concentración de iones de Mg. en la disolución. Tampoco debe haber determinados factores sanguíneos, fenol, detergentes… que inhibirían la actividad de la polimerasa.
· Cantidad de la muestra: si se dispone de suficiente cantidad para la amplificación de ADN genómico de copia única se usan cantidades de 100-500 ng. En el caso de zonas repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-50 ng. El mínimo oscila entre 10-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng.
Diseño de los iniciadores
Para la elección de los primers, existen una serie de normas que nos pueden ayudar, aunque hay que indicar también que existen programas de ordenador que nos facilitan esta tarea (DNAsis, Primer3, etc.).
· El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%. La relación máxima de purinas/pirimidinas será 60%/40%.
· Deben evitarse zonas con largas secuencias de una sola base.
· No seleccionar cebadores que en su extremo 3´ tenga una importante estructura secundaria.
· Se recomienda que los extremos las últimas bases sean G o C.
· Se debe evitar la complementariedad entre la pareja de iniciadores. Si esta existe entre los extremos 3´existe la posibilidad de que se formen dímeros de iniciadores.
· Normalmente deben tener un tamaño de 18-30 pb.
· La Temperatura de hibridación de los cebadores debe ser similar en ambos y será variable en función de la secuencia de los mismos. Generalmente oscila entre los 45 y 60 ° C.
· Si el primer es menor a 20 pb, la temperatura de fusión (Tm), se calcula en base a la siguiente fórmula:
Tm= 4 (G+C) + 2(A+T) Siendo G, C, T y A el número de cada una de las bases que forman cada uno de los oligos. La temperatura de hibridación debe ser aproximadamente 5º menor que la temperatura calculada.
DNA Polimerasa
Existen diferentes tipos de DNA polimerasa que llevan a cabo la replicación del ADN, siguiendo el mismo método de síntesis. Se pueden clasificar en:
Inicialmente se usó el fragmento Klenow de la DNA polimerasa de E. coli (Saiki y cols., 1985) la cual posee actividad 3´-> 5´ exonucleasa que le proporciona la capacidad de cambiar el nucleótido que ha sido erróneamente incorporado. La importancia de esta actividad radica en que aumenta la fidelidad de la replicación del ADN original. Sin embargo, se trata de una enzima termolábil por lo que no soporta los ciclos y temperaturas utilizados en una PCR. Actualmente la polimerasa que se utiliza es la Taq polimerasa (Estivil, 1991). Es una enzima termoestable aislada de Termus aquaticus (Taq), una bacteria que soporta altas temperaturas. La Taq polimerasa ha simplificado enormemente la técnica de la PCR, ya que ha permitido su automatización (desarrollo del termociclador). Como se observa en las Tablas anteriormente descritas, las polimerasas termoestables, como la Taq polimerasa, carecen de actividad 3´-> 5´ exonucleasa, lo que las hace menos seguras a la hora de comparar las fidelidades. Por ello hay que intentar conseguir las mejores condiciones para que ésta aumente. Podemos citar:
· No usar un alto número de ciclos, ya que la tasa de error es proporcional al número de estos. Normalmente el número de ciclos utilizado es de 25-30.
· La concentración de los deoxinucleótidos (dNTPs) debe ser igual para los 4 y debe ser la más baja posible para que nos permita conseguir la cantidad de ADN necesaria.
· Disminuir en lo posible el tiempo de cada etapa.
· La concentración de Mg++ en la reacción oscila entre 0,50 y 2,5 mM. Se trata de un ión necesario, pero su exceso hace que disminuya la especificidad de la PCR.
Deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs)
Son cuatro: dATP, dGTP, dCTP y dTTP. Como hemos señalado anteriormente se deben añadir en la solución de la reacción en concentraciones iguales que normalmente oscila entre los 20 y los 200 mbol" > mM. Los dNTPs pueden captar Mg++, por lo que las concentraciones de ambos componentes deben guardar siempre la misma relación. No debemos variar ninguno de ello de manera independiente. Se aconseja (Bradley, 1991) que la concentración de Mg++ sea de 0.5 – 1.0 mM veces superior a la concentración de dNTPs.
Amortiguador de la reacción
Por lo general está formado por: 10 mM tris-HCl (pH=8.4 a Tª ambiente), 50 mM KCl, 0.1% w/v gelatina y 1.5 mM MgCl2. Algunos autores recomiendan el uso de adyuvantes, los cuales ayudarían en la práctica a aumentar la especificidad y fidelidad de la reacción en cadena de la polimerasa. El dimetilsulfóxido (DMSO) añadido al buffer de la reacción en un 10% contribuye a la disminución de la estructura secundaria del ADN (Anderson, 1990). También se pueden usar detergentes como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o Tritón x10, que ayudan a estabilizar la enzima. Existen también protocolos que incorporan polietilenglicol (PEG), glicerol, formamida, seroalbúmina bovina (BSA), etc, aunque no son en ningún caso imprescindibles. Sales Es de gran importancia la concentración de dos cationes que son añadidos en forma de sales.
· Cloruro potásico (KCl). Influye en la desnaturalización del ADN.
Elevadas concentraciones del ión K+ favorece la desnaturalización de secuencias cortas de ADN. Bajas concentraciones de K+ ayudan a la desnaturalización de secuencias largas de ADN.
· Cloruro de magnesio (MgCl2). Aumenta la temperatura de hibridación del DNA. La concentración de este ion resulta fundamental para la optimización de la reacción.
Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especificidad de la reacción.
Bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de la reacción Temperaturas y tiempos de los ciclos Como hemos explicado anteriormente la Reacción en Cadena de la Polimerasa se realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que repite durante un número determinado de veces. El tiempo, la temperatura y el número de ciclos son factores determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto modificándolos podemos optimizar la reacción. Las primeras reacciones se realizaban manualmente cambiando continuamente los tubos de un baño María a otro de diferente temperatura (la Tª de desnaturalización, la de hibridación y la de elongación). El proceso resultaba demasiado tedioso y era difícil alcanzar las temperaturas y los tiempos correctos, por lo que se desarrolló el termociclador que lo hacía de manera automática. A continuación describiremos de forma más detallada el tiempo y la temperatura de cada una de las etapas de un ciclo. 1.- Desnaturalización Se trata de una etapa crítica ya que es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera adecuada se recomiendan temperaturas de 94ºC durante 30 segundos a 1 minuto Tiene alto contenido de G + C puede aumentar el tiempo o la temperatura.
Sin embargo hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima decrece de manera muy rápida a partir de los 95ºC, por lo que a estas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubación.
En la práctica se suele añadir un período de desnaturalización antes de comenzar los ciclos para asegurarnos que se produce a lo largo de toda la muestra de ADN. Esta etapa suele ser de 5´a 94ºC. 2.- Hibridación En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3 factores relacionados con los oligonucleótidos: la composición de bases, el tamaño y la concentración.
En la práctica, la temperatura de hibridación puede oscilar entre 45ºC y 65ºC, durante un tiempo comprendido entre 30 segundos y 1 minuto. Un aumento de temperatura o del tiempo favorece la especificidad ya que disminuye las uniones incorrectas de los iniciadores con la hebra molde.
3.- Elongación En la mayoría de las reacciones, la etapa de extensión se realiza a 72ºC. Teóricamente esta temperatura puede variar entre 70-72ºC. El tiempo de extensión depende del tamaño de la amplificación. Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para elongar 1 Kb En la práctica es normal que al final de todos los ciclos se realice una última elongación de 5´a 72ºC. Número de ciclos También adquiere gran relevancia a la hora de optimizar una PCR el número de ciclos que se utilizan. Este número depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados (normalmente de manera empírica). Es importante no realizar un número alto de ciclos ya que puede dar lugar a la amplificación de productos no deseados originados por hibridaciones no específicas. Hay que tener en cuenta que la reacción está producida por una enzima que sufre el efecto meseta que describe la atenuación en la tasa de la acumulación del producto. Después de un número determinado de ciclos la amplificación deja producirse de manera exponencial y llega a una fase estacionaria. Generalmente cuando el efecto meseta se produce, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente para su posterior utilización.
Contaminación en la PCR
La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica muy sensible, por lo que es de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado (aunque se encuentre en una cantidad muy pequeña) se amplifique y obtengamos un resultado que no es real. Vemos que una de sus mayores ventajas de la técnica, se convierte a la vez en el principal inconveniente (Kwok y Higuchi, 1989). Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones. En el caso de trabajar con muestras de ARN las precauciones se deben extremar al máximo:
· Lugar físico exclusivo para realizar la PCR
· Uso de instrumental exclusivo para la PCR
· Utilización de reactivos y tubos estériles
· Uso de guantes por el manipulador
· Realización de controles de blanco (se añade agua en lugar de ADN, no debe existir amplificación).
Aplicaciones de la secuenciación de ADN
Detección de mutaciones: La técnica de PCR nos permite localizar mutaciones previamente descritas. Se emplea así en la secuenciación de ADN como un método de diagnóstico: Una vez que se ha caracterizado la relación con una enfermedad de una determinada mutación puntual (mutaciones en el gen de la galactosa 1P uridiltransferasa en la galactosemia, mutaciones en c-Ras y cáncer, etc.) o de una pequeña deleción (deleción de tres bases en el gen CFTR de fibrosis quística ) puede desarrollarse un método de detección rutinario , la secuenciación automática puede implementarse como método de screening para la localización de nuevas mutaciones.
secuencias de ADN a partir de unas pocas copias intactas presentes en especimenes de museos y descubrimientos arqueológicos en los cuales la mayoría de las moléculas están dañadas o degradadas, para proceder posteriormente a su estudio mediante secuenciación.
Diagnóstico prenatal/Diagnóstico preimplantación: diagnóstico de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos de fecundación in Vitro.
Una o dos células del preembrión se retiran en el estado de ocho a dieciséis células, previo a la implantación. Estas pueden utilizarse para amplificar un gen o genes específicos y así estudiar la enfermedad genética o el sexo (utilizando genes específicos del cromosoma Y).
Secuenciación de ADNs fósiles: El uso del PCR ha abierto la posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias intactas presentes en especimenes de museo y descubrimientos arqueológicos en los cuales la mayoría de las moléculas están dañadas o degradadas, para proceder posteriormente a su estudio mediante secuenciación.
Identificación de especies y Control de cruzas entre animales: Las técnicas para identificar especies pueden ser muy importantes para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie mas barata a los precios de otra mas cara, o el comercio ilegal de especies en peligro. Estos estudios pueden realizarse utilizando el ADN mitocondrial, el cual presenta secuencias altamente variables entre especies distintas, auque sean cercanas entre sí, y bastante conservadas dentro de la misma especie.
Los controles de relaciones Familiares entre animales tiene importancia forense para el control de comercio ilegal de especies protegidas. Individuos jóvenes de especies en peligro son sacados de sus lugares de nacimiento y disfrazados por certificados veterinarios falsos. En estos casos el estudio familiar es el único medio de descubrir el origen ilegal de los individuos.
Proyecto Genoma Humano: El proyecto genoma humano es un proyecto Internacional cuyo objetivo final es obtener una descripción completa del genoma humano a través de la secuenciación del ADN. El genoma que se investiga es el genoma nuclear. Desde su inicio el proyecto ha sido justificado especialmente por los beneficios médicos que se espera obtener del conocimiento de la estructura de cada gen humano. Esta información proporciona una capacidad de diagnóstico en individuos con riesgo de ser portadores del gen de alguna enfermedad además de proporcionar un marco de trabajo para el desarrollo de nuevas terapias, además de nuevas estrategias para la terapia génica.
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Autor:
Q.C. Margarita Lozada Méndez.
pinpon70[arroba]hotmail.com
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