Descripción de un protocolo estandarizado de toxicidad aguda para cladóceros (página 2)

4. Bioensayos de toxicidad aguda con
cladóceros

Las especies recomendadas por Rodríguez y
Esclapés (1995) y Esclapés (1999) son Moina
macrocopa (Figura 4), Daphnia magna y Daphnia pulex (Figura 5);
mientras C.I.I.D. (1998) recomienda Daphnia magna; la
Environmental Protection Agency (E.P.A., 1985) y la American
Public Health Association (A.P.H.A., 1989) aceptan Daphnia magna
y Daphnia pulex.

Preparación de Medio de Cultivo:
Solución madre de KCl:

• Colocar 8 g de KCl (grado reactivo) en un
  balón volumétrico de 1 l
• Aforar a 1 l con agua
  destilada
• Almacenar en botellas de polietileno de 1 l
  (Esclapés, 1999).

Solución madre de MgSO4:

• Colocar 120 g de MgSO4 anhidro (grado
  reactivo) en un balón volumétrico de 1
  l
• Aforar a 1 l con agua
  destilada
• Almacenar en botellas de polietileno de 1 l
  (Esclapés, 1999).

Solución madre de NaHCO3:

• Colocar 96 g de NaHCO3 (grado reactivo) en
  un balón volumétrico de 1 l
• Aforar a 1 l con agua destilada

Figura 4.- Vista general de Moina macrocopa.

Fuente: http://www-public.tu-bs.de:8080/~y0008601/leben.html

Fuente: http:
www.cellsalive.com/ cards/daphn_th.gif

• Almacenar en botellas de polietileno de 1 l
  (Esclapés, 1999).

Agua sintética dura (160-180 mg/l
CaCO3): cultivos de Daphnia magna y Moina
macrocopa:

• Añadir 18,2 l de agua destilada en un envase
  plástico
  limpio de 20 l
• Adicionar 2,4 g de CaSO4.2H2O a
  1 l de agua destilada, contenida en un vaso precipitado de 2 l,
  revolver hasta disolver por completo el soluto. Transferir la
  solución al envase de 20 l donde se mezclará con
  el agua
  contenida en el recipiente mencionado (Esclapés,
  1999).
• Adicionalmente agregar al envase de 20 l las soluciones
  madres en los siguientes volúmenes:
• • 20 ml de KCl
  • 20 ml de MgSO4
  • 40 ml de NaHCO3 (Esclapés,
    1999).

Suministrar aireación durante más de 2
horas antes de su utilización. El pH inicial del
medio será aproximadamente de 8,0 y durante el cultivo
podrá variar entre 7,0 – 8,6, entre cuyo intervalo
no se requiere ajuste (Esclapés, 1999).
Agua sintética moderadamente dura (80-90 mg/l
CaCO3): cultivos de Daphnia pulex:
Se diluye el medio duro antes descrito a la mitad, empleando agua
destilada (Esclapés, 1999).
Preparación de Medio de Cultivo para Microalgas:
Solución madre 1:
Disolver en 500 ml de agua destilada:
MgCl2.6H2O 6,08 g
CaCl2.2H2O 2,20 g
H3BO3 92,80 mg
MnCl2.4H2O 208 mg
ZnCl2 1,64 mg (pesar 164 mg, diluir en 100 ml de agua
destilada y añadir 1 ml en solución madre)
FeCl3.6H2O 79,90 mg
CoCl2.6H2O 0,714 mg (pesar 7,14 mg, diluir
en 100 ml de agua destilada y añadir en
solución
madre)
Na2MoO4.2H2O 3,63 mg (pesar 36,6
mg, diluir en 10 ml de agua destilada y añadir 1 ml en
solución madre)
CuCl2.6H2O 0,714 mg (pesar 60 mg, diluir en
1 l de agua destilada. tomar 1 ml y diluir en 10 ml de agua
destilada. Añadir 1 ml de la última dilución
en solución madre) (Esclapés, 1999).

Solución madre 2:
Disolver en 500 ml de agua destilada:
NaNO3 12,75 g (Esclapés, 1999).

Solución madre 3:
Disolver en 500 ml de agua destilada:
MgSO4.7H2O 7,35 g (Esclapés,
1999).

Solución madre 4:
Disolver en 500 ml de agua destilada:
K2HPO4 0,522 g (Esclapés,
1999).

Solución madre 5:
Disolver en 500 ml de agua destilada:
NaHCO3 7,50 g (Esclapés, 1999).

Medio de cultivo
Añadir 1 ml de cada solución madre en 900 ml de
agua destilada. Se debe mezclar después de agregar cada
solución. Aforar hasta 1 l, mezclar bien y ajustar el
pH a 7,5
± 0,1; utilizando 0,1 N de ácido clorhídrico
o de hidróxido de sodio, como se requiera. Luego se debe
filtrar a través de una membrana de 0,45 µm de
diámetro de poro, utilizando un vacío máximo
de 380 mm de mercurio o una presión no
mayor de 1,5 atmósferas (8 psi).
Previamente el filtro debe ser lavado con 500 ml de agua
destilada. Si la filtración se realiza con equipo
estéril, el medio filtrado se puede colocar directamente
en los envases de cultivo estériles, de lo contrario puede
esterilizarse en un autoclave pero el pH debe ser verificado
(Esclapés, 1999).

Cultivo y Mantenimiento:
Los cladóceros se colocan en vasos precipitados de 3 l de
capacidad en un número de aproximadamente 40 organismos/2
l de medio de cultivo. Aproximadamente, un 80 % de medio de
cultivo se debe sustituir semanalmente por medio previamente
aireado. Los organismos se alimentan cada dos días con un
concentrado mixto de microalgas (Figura 6) (Selenastrum
capricornutum, Ankistrodesmus sp., Chlorella sp. y
fitoflagelados) con una concentración aproximada de
4×108 cel/ml (Esclapés, 1999). Diariamente se
debe realizar una limpieza del acuario, retirando las mudas
producidas (C.I.I.D., 1998).
El Centro Internacional de Investigaciones
para el Desarrollo
(1998) recomienda alimentar los cladóceros diariamente con
un cultivo de Selenastrum capricornutum, a un volumen calculado
con la siguiente formula:
V = (AxB)/C (2)

Donde:
V = volumen del
concentrado algal
A = número de cladóceros por acuario
B = dosis recomendada (1,5 x 106 células
por cladócero/día)
C = concentración de la solución algal
(número de células/ml)
Fuente:
http://www.protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Chlorophyta/Selenastrum/

Preparación y Manipulación de los
Organismos:
El día anterior a las pruebas, se
separan las hembras que posean embriones en avanzado estado de
desarrollo y
se coloca cada hembra en un envase de vidrio de 15 ml
de capacidad con 10 ml de medio de cultivo. Los neonatos se
separan con una pipeta Pasteur y se transfirieren a los envases
de exposición, comenzando por el control y
terminando con las concentraciones más altas. Se debe
tener cuidado en el proceso
transferencia de no añadir demasiado medio de cultivo para
no alterar las concentraciones. Cada envase se cubre con papel plástico
transparente (Esclapés, 1999).

Condiciones Durante el Bioensayo
La Tabla 3 describe las condiciones necesarias y óptimas
requeridas durante la realización de bioensayos de
toxicidad aguda que utilicen cladóceros como organismos de
prueba.
El C.I.I.D. (1998) recomienda una intensidad lumínica
de ± 800
lux, un fotoperíodo de 16:8 h luz:oscuridad,
temperatura de
21 ± 2
ºC y la confirmación de los individuos muertos
mediante la observación de la suspensión de
latido del corazón
con un microscopio
estereoscópico.

Tabla 3.-
Condiciones necesarias durante un bioensayo de toxicidad aguda
con cladóceros.

(Esclapés, 1999).

5. Conclusiones y
Recomendaciones

• Las actividades humanas producen desechos los cuales
  son eliminados a los ecosistemas
  sin un debido tratamiento, generando alteraciones a los
  equilibrios presentes y afectando de manera negativa a las
  especies más sensibles que allí habitan, llegando
  incluso a ocasionar su extinción.
• Los bioensayos permiten conocer el efecto que
  producen las sustancias químicas sobre los organismos
  vivos.
• Las especies de mayor importancia para los bioensayos
  son las más sensibles ya que establecen las
  concentraciones máximas permisibles para las descargas
  al medio, sin que se produzca un daño irremediable al
  ambiente.
• Las primeras etapas de los ciclos de vida de los
  organismos son generalmente las más sensibles a la
  presencia de sustancias tóxicas y por ende las
  más utilizadas en los bioensayos.
• Los organismos estandarizados provenientes de
  laboratorios son los más utilizados en los bioensayos ya
  que se conoce su biología, son de
  fácil cultivo, de gran disponibilidad, acondicionados al
  laboratorio,
  de mayor respuesta y los resultados obtenidos pueden ser
  comparados con los de otras experiencias.
• Los invertebrados son los organismos universalmente
  usados en los bioensayos debido a su pequeño
  tamaño, corto ciclo de
  vida, fácil cultivo, alta sensibilidad por ocupar
  los primeros eslabones de la trama trófica.
• Los cladóceros son ampliamente recomendados en
  los bioensayos por presentar todas las características necesarias.
• Una de las principales ventajas de los bioensayos con
  protocolos
  estandarizados es que permite su reproducción en cualquier lugar y
  tiempo,
  generando mayor importancia a las hipótesis y conclusiones
  alcanzadas.

Recomendaciones

• Al realizar bioensayos es recomendable seleccionar
  las especies más sensibles y en etapas juveniles ya que
  estos son los individuos más afectados al momento de la
  introducción de sustancias
  antropogénicas al medio.
• Todas las sustancias químicas que son
  liberadas al medio provenientes de actividades humanas
  deberían estar reguladas por leyes que
  utilicen los datos
  resultantes de los bioensayos.
• Si se desea solo evaluar la afectación de una
  zona y un problema en particular se debe elaborar un bioensayo
  con especies presentes en ese medio y con los elementos
  más similares al sitio afectado, ya que las respuestas
  en los ecosistemas
  no son siempre iguales.

6.
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Resumen
Los bioensayos o pruebas de toxicidad son experimentos que
miden el efecto de uno o más contaminantes en una o
más especies. Se clasifican en: ensayos de respuesta
directa, representados por los bioensayos de toxicidad, y ensayos
de respuesta indirecta formado por ensayos organolépticos
y ensayos de bioestimulación. Pueden realizarse en el
laboratorio bajo condiciones controladas o en el campo
directamente en el medio natural. En un estudio ambiental
específico de una localidad es necesario realizar
conjuntamente con los ensayos toxicológicos una
caracterización físico-química del medio.
Cuando varias sustancias químicas se encuentran presentes
en un cuerpo de agua, la interacción toxicológica
entre estas sustancias puede invalidar los datos de
toxicidad de las sustancias aisladas. Los organismos
óptimos para los bioensayos deben ser representativos del
ambiente estudiado, con amplia distribución, de gran disponibilidad,
tamaño manejable, fácil cultivo y muy sensibles;
los organismos cultivados en laboratorios presentan mayores
ventajas que los colectados en el campo. Los cladóceros se
encuentran entre los organismos más utilizados para los
bioensayos ya que cumplen con las características requeridas. Todo el
material a utilizar en las pruebas debe ser tratado de manera
especial. Las diluciones de las sustancias evaluadas se preparan
a partir de una solución madre con vidriera
volumétrica. Si se desconoce la toxicidad de la sustancia
es necesario realizar pruebas preliminares de tanteo para
determinar las concentraciones que serán utilizadas en
el ensayo
definitivo. Durante el bioensayo es necesario evaluar el oxígeno
y el pH, siendo todas las condiciones controladas. El programa
computarizado de Stephan (1977) realiza el cálculo
estadístico de los resultados mediante cuatro diferentes
medios,
calculando el CL50. Los bioensayos de toxicidad aguda
con cladóceros se encuentran entre los más
utilizados a nivel mundial, generalmente con Daphnia. Para su
mantenimiento
es necesario la preparación de medio de cultivo duro
(160-180 mg/l CaCO3 para Daphnia magna y Moina
macrocopa, y 80-90 mg/l CaCO3 para Daphnia pulex) y de
un medio para microalgas que son su alimento.

Autor:

César Augusto Mac-Quhae.