ADN molde
Primers
Taq polimerasa
dNTPs
MgCl2
Buffer
Fluorocromo
PCR en Tiempo Real: Componentes de la mezcla de reacción.
PCR en Tiempo Real vs. PCR convencional.
PCR en Tiempo Real vs. PCR convencional.
PCR convencional.
PCR en Tiempo Real.
PCR en Tiempo Real: ventajas.
Sensibilidad
Cuantificación
Monitoreo de todo el procedimiento
Disminución del riesgo de contaminación
Automatización
Amplicones pequeños
Amplio rango dinámico
Transcripción reversa
PCR en Tiempo Real: Fases de la curva de amplificación
Donde: ?Rn es la intensidad de emisión de fluorescencia y se calcula como la diferencia en laemisión de fluorescencia normalizada (Rn) de la muestra y de un control sin templado (control negativo).
Etapas de la PCR en Tiempo Real.
Los pasos de PCR y detección de productos son llevados a cabo por el equipo de PCR en Tiempo Real.
PCR en Tiempo Real: preparación de la muestra.
PCR en Tiempo Real en un paso:
La retrotranscripción y amplificación ocurren en el mismo tubo. Ventajas: se minimizan las variaciones experimentales y la posibilidad de contaminaciones. Desventajas: El ADNc generado sirve solo para una amplificación y se ha reportado que es menos sensible.
PCR en Tiempo Real en dos pasos
La retrotranscripción y amplificación ocurren separadamente. Ventajas: permite corroborar la eficiencia de la retrotranscripción y mayor sensibilidad. Desventajas: Mayor probabilidad de contaminación de la muestra.
PCR en Tiempo Real: instrumentación.
Composición del equipo:
Termociclador.
Lector de fluorescencia.
Recolector de datos.
Conforman el mismo instrumento.
Canales de lectura.
Energía de excitación.
PCR en Tiempo Real: instrumentación.
Tipos de emisores de energía disponibles:
Lámparas (de halógeno o cuarzo).
Diodos emisores de luz (LEDs).
Láseres.
La mayoría de los equipos presentan lectores de fluorescencia que permiten leer múltiples longitudes de onda simultáneamente. Esto posibilita el desarrollo de reacciones multiplex.
PCR en Tiempo Real: instrumentación.
PCR en Tiempo Real: consideraciones de amplificación.
El buffer de reacción contiene: MgCl2, KCl, dNTPs y Taq polimerasa. En caso de usarse un colorante de unión al ADN para cuatificación, este también viene incluído.
En el caso del uso de sondas fluorescentes, estas se agregan a la mezcla de reacción por el operador
La longitud óptima del amplicón es < 100 pb. Sin embargo, se amplifican bien fragmentos de hasta 200 pb.
La concentración de ADN inicial está entre 1-100 ng.
En el caso del uso de sondas, estas deben tener un Tm 10ºC mayor que el de los primers..
PCR en Tiempo Real: definición de ciclo umbral.
En la fase exponencial temprana, la intensidad de fluorescencia alcanza un umbral que es significativamente mayor que la la fluorescencia de fondo. El ciclo en que esto ocurre se denomina Ct (threshold cycle).
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