Electroporación para células pegadas
Biobalística
Microinyección
Métodos de transfección
Vectores de expresión eucariontes
Elementos para clonado en bacterias
ori de replicación
Marcador de selección bacteriano
Sitios múltiples de clonado
Elementos específicos de vectores eucariontes
_ Promotor eucarionte
Señal de poliadenilación
Secuencias Kozak y codón ATG
Intrón
Tags-proteínas de fusión
ori de replicación eucarionte como el de SV40 (opcional)
Marcador de selección para células eucariontes (para transfecciones estables)
Segmentos de DNA para recombinación homóloga
Vector de expresión eucarionte
Promotores eucariontes
Constitutivos:
SV40
RSV
CMV
hEF-1a
Ubc
Inducibles:
Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclina
Olac inducible por IPTG
Metalotioneína inducible por metales pesados
GAL4-E1b inducible por mifepristona
Tags
Glutation-S-transferasa
His
V5
Hemoaglutinina (HA)
Myc
Flag
EGFP
Elementos de control de la traducción
5’ leader
3’ trailer
1
2
3
5
gen de interés
4
Región transcribible del gen
1 AUG (secuencia Kozak = CCRCCAUGG)
2 Secuencia señal de secreción
3 Tag para su purificación
Sitio de clivaje proteolítico
Señal de poliadenilación
Transfección transiente
(48-72 horas)
Análisis rápido
Múltiples propósitos
Análisis de secuencias regulatorias
Vector de expresión
Vector de expresión
Proteínas producidas en cultivos de células eucariontes
Proteína Condición
Factor IX & VIIIc hemophiliacs
CD4 receptor AIDS
erythropoetin cancer
b & g interferons cancer
Interleukin-2 cancer
growth hormone dwarfism
tissue plasminogen activator heart attack/stroke
Hepatitis B surface antigen vaccine
monoclonal antibodies various
Vector de fusión a EGFP
Vector de fusión a ZsYellow
(Gp:)
Expresión de proteínas fluorescentes
Proteína fluorescente verde
Vector de anclaje a membrana de la proteína
Vector de secreción de la proteína
Dos vectores de expresión diferentes
El número de copias de cada plásmido puede ser diferente
La expresión de cada proteína puede ser diferente
Vectores que expresan dos genes
Cada gen es una unidad transcripcional y tiene su promotor y secuencia de poliadenilación
Pueden no expresar la misma cantidad de protína
Vectores dicistrónicos
Posee un solo promotor
2 genes a partir de la misma unidad transcripcional
Se sintetiza un solo mRNA
Necesita un sitio interno de unión al ribosoma
IRES proviene del genoma de virus de mamíferos
Vectores dicistrónicos
(Gp:) Gen reportero para análisis de promotores
ANALISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
(Gp:) PROMOTOR
(Gp:) exón 1
(Gp:) exón 2
(Gp:) intrón
(Gp:) 5’
(Gp:) 3’
(Gp:) transcripción
(Gp:) La mayoría de los cambios en los niveles de mRNA ocurren por variaciones en la transcripción.
(Gp:) m7GpppN
(Gp:) AAAAAA
(Gp:) 5’
(Gp:) 3’
(Gp:) mRNA
Los genes reporteros son secuencias que codifican para proteínas de simple detección. Se usan para reemplazar productos génicos difíciles de medir y determinar actividad promotora.
(Gp:) PROMOTOR
(Gp:) exón 1
(Gp:) exón 2
(Gp:) intrón
(Gp:) 5’
(Gp:) 3’
(Gp:) PROMOTOR
(Gp:) GEN REPORTEROe.g. luciferasa
Estrategia de genes reporteros
CAT (cloramfenicol acetiltransferasa)Transfiere grupos acetilos marcados 14C o 3H al cloramfenicol.La detección se da por cromatografía en capa delgada o extracción orgánica
GAL (?-galactosidasa)Hidroliza sustrato incoloro (ONPG) para dar producto amarillo que se cuantifica
SEAP (secreted human placental alkaline phosphatase)Ensayo de fosfatasa alcalina bioluminiscente. Muy sensible
LUC (luciferasa)Oxida a la luciferina emitiendo fotones. Los fotones se cuentan en un luminómetro o una cámara de recuento de fotones (ensayo in vivo). Hay diferentes luciferasas dispoinibles
GFP (green fluorescent protein)Fluoresce por irradiación con UV – se observa con microscopio de fluorescencia.
Genes reporteros
Vector para analizar secuencias promotoras.
Vector para analizar secuencias promotoras.
Vector control-secuencias regulatorias
Vector control-secuencias regulatorias
Diseño y construcción del vector
Ensayo de genes reporteros
Introducción en células por transfección transiente o estable
(Gp:) Gen reportero
(ej luciferasa)
Ensayo de actividad
Gen control
(ej b-galactosidasa)
Cálculo de actividad promotora
Vector control de eficiencia de transformación
Vector control de eficiencia de transformación
Co-transfección de genes reporterosDual Luciferase Assay system – Promega
Se clona el promotor de interés delante del gen de luciferasa (firefly) y se usa la luciferasa de Renilla como control interno
La luciferasa de Renilla se expresa de un promotor constitutivoe.g. SV40 I/E HSV TK
Ejemplo de resultado
Analisis de una región promotora
Qué secuencias están involucradas en la regulación?Análisis de genes reporteros y análisis por deleción
CIS -acting elementsElementos de respuesta
Qué proteínas se unen a estos elementos?Análisis de DNase I footprinting Ensayo de retardo en gel
CHIP
TRANS -acting factors e.g. factores de transcripción específicos
Interacción de proteínas:Doble híbrido en células de mamífero
pBIND
pACT
pG5/luc
Ejemplo de resultados
Transfección estable
Por integración
Por recombinación homóloga
Como episoma
Requiere de un marcador de selección en el vector
Util para estudios que impliquen inducción de la expresión
Marcadores de selección eucariontes
Agent Action Marker Gene
Blasticidin S Inhiben síntesis BlasticidinS deaminase
Hygromycin B proteica Gen hyg o hph
Puromycin
G-418 Neomycin phosphotransferase
Zeocina Intercalante del DNA gen Sh ble, se une
MTX Inhibits DNA syn. Dihydrofolate reductase
Marcadores de selección
Metotrexate (MTX)
Mata a las células que carecen de dihidrofolato reductasa
La línea celular huesped debe ser DHFR-
El vector contiene el gen DHFR
Incrementos en [MTX] aumenta el número de copias génicas
G418 (Geneticina)
Bloquea la traducción
La resistencia es la neomicina fosfotransferasa ( Neor )
Para células de mamífero, plantas y levaduras
Zeocina
– Antibiótico de la familia bleomicina
– Cliva el DNA
– El producto del gen ble se une e impide el pegado al DNA.
-de amplio espectro (mamíferos, levaduras y bacterias)
Vector episomal
Sistema de recombinación homóloga
Flp-in Invitrogen: Recombinación sitio específica de Saccharomyces cerevisiae
Sitio FRT (Flp recombination target)
Recombinasa Flp
Vector que contiene el sitio FRT
Pasos de recombinación homóloga
1- Generar línea que posea el sitio FRT
Vector de clonado del gen de interés
Vector de clonado del gen de interés
Vector de expresión de la recombinasa
2- Cotransfectar con vector con gen de interés y vector de expresión para recombinasa
Resultado
Sistema siRNA
Estrategias siRNA
Vector siRNA
Sistema reprimible por tetraciclina
Sistema inducible por tetraciclina
Vector de expresión del regulador
Vector de expresión del regulador
Vector de clonado del gen de interés
Vector de expresión para dos genes regulados por tet
Vector de expresión de proteínas en leche
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