Sistemas de modificación celular
SubIntroducción
Genes marcadores
Técnicas de introducción de ADN en las células animales en cultivo
Transfección
Métodos químicos
Métodos físicos
Establecimiento de líneas de expresión estable
Transducción: vectores virales
Adenovirus
Retrovirus y Lentivirus
Métodos de introducción de proteínas
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Manipulación del cultivo celular para la modificación de la expresión y/o función de los genes.
Ácidos nucleicos
ADN: construcciones con la secuencia codificante del gen de interés,…
ARN: puede ser codificante o regulador (RNAi o antisense)
Proteínas: para evaluar su función o inhibirla con proteínas competidoras (dominante negativo)
Anticuerpos: para neutralizar la función de una proteína
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¿Con qué finalidad queremos introducir ADN en una célula?
Conferirle ventajas selectivas (ej. resistencia a una sustancia tóxica)
Caracterizar la función de la proteína de interés
Conocer la localización subcelular de una proteína (proteína marcada)
Facilitar el estudio de la regulación de la expresión de un gen (región reguladora de la expresión del gen + gen marcador)
Obtener proteína recombinante procesada correctamente por células de mamífero
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Condiciones ideales de introducción del ADN
El método y las condiciones óptimos para cada tipo celular se tienen que establecer empíricamente
Eficiencia máxima
Toxicidad nula
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Estrategias de introducción de ADN
Transfección: introducción del gen exógeno por métodos químicos o físicos
Vector: plásmido de expresión
Transducción o infección: introducción del gen exógeno mediante vectores virales
Vector: material genético del virus
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Transfección: vector
Componentes de un plásmido de expresión de
células de mamífero:
Origen de replicación en bacterias (ColE1): para mantener y amplificar el ADN
Gen de resistencia a un antibiótico (p.e. ampicilina): para seleccionar las bacterias que tienen el plásmido
Promotor secuencia que controla la expresión del transgen (p.e. pRSV expresión elevada y constitutiva)
Sitio de clonage: “multi cloning site” MCS (donde se introduce la secuencia de ADN de interés)
Señal de poliadenilación (finalización del ARN mensajero)
Gen de resistencia a un antibiótico para la selección de las células que han incorporado el plásmido en su genoma (p.e. Neomicina o Higromicina).
(Gp:) Amplificación del vector en bacterias
(Gp:) Expresión del gen en células de mamífero y selección de clones estables
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Vector de expresión para células de mamífero
MCS: multi cloning site
Para amplificación
y selección en bacterias
Promotor
Seq. de poliadenilación
Promotor
Gen de resistencia a la neomicina
(selección en céls. mamífero)
Seq. de poliadenilación
http://www.invitrogen.com
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Permiten:
Controlar la eficiencia de entrada del ADN
Estudiar la regulación de la expresión de un gen
Monitorizar la localización subcelular de la proteína
Genes marcadores o “reporter”
Aplicaciones:
Normalización de los ensayos de expresión
Seguimiento de una proteína marcada con un gen reporter
Optimización de la metodología de introducción del ADN
Codifican para proteínas de fácil detección
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Genes “reporter” más comunes
Chloramphenicol acetyl transferase (CAT)
Enzima bacteriano que transfiere grupos acetilo del acetil-coenzima A al antibiótico cloranfenicol. El ensayo CAT se realiza con cloranfenicol radiactivo por lo que se detecta por autorradiografía.
Luciferasa (luc)
Enzima expresado en la luciérnaga Photinus pyralis. Cataliza la oxidación de las luciferinas, reacción que emite luz. La producción de luz se puede medir con un luminómetro.
?-galactosidasa (?-gal or lacZ)
Enzima bacteriano muy versátil, su actividad se puede medir tanto en extractos celulares con un espectrofotómetro (aparición de producto coloreado) y por métodos histoquímicos con la aparición de un precipitado azul en las células que lo expresan.
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Green fluorescent protein (GFP)
El gen de esta proteína autofluorescente ha sido el gen marcador más útil para visualizar las células transfectadas in vivo.
La GFP se obtuvo de la medusa Aequorea victoria.
La exposición de la GFP a luz ultravioleta produce la emisión de una luz verde brillante en células vivas, sin la necesidad de añadir ningún sustrato o producto.
En la actualidad se han clonado proteínas fluorescentes a partir de otras especies de medusa, anémonas y corales
AmCyan1 ZsGreen1 ZsYellow1 DsRed1 AsRed2 HcRed1.
Nuevas proteínas fluorescentes disponibles:
Genes “reporter” más comunes
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Métodos de Transfección
Métodos químicos:
Se mezcla el ADN con moléculas cargadas positivamente que facilitan la entrada del ADN en la célula (moléculas portadoras o “carrier”)
Métodos físicos:
Introducción del ADN de forma directa
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Métodos de Transfección
Métodos químicos:
Coprecipitación con fosfato cálcico
DEAE-dextrano
Lípidos catiónicos
Polyethylenimine (PEI)
Métodos físicos:
Electroporación
Microinyección
“Biolistic Particle Delivery” o “Gene gun”
Magnetofección
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